Иммуномодулятор метаболитууд хадаа хабдарай микрооршоной (ТМО) гол шэнжэ тэмдэг болоно, зүгөөр хэдэн онсогой ушарнуудһаа бусад тохёолдолнууд ехэнхидээ мэдэгдээгүй байна. Эндэ бидэ эдэ ондо ондоо ТМЭ таһагуудай метаболомые элирүүлхын тулада үндэр зэргын серозно карцинома (HGSC) үбшэнтэнэй хабдар ба асцитһаа хабдар ба Т эсүүдые шэнжэлээбди. Асцит ба хабдарай эсүүд үргэн метаболит илгаануудтай. Асциттай харисуулхада, хабдар нэбтэрһэн Т эсүүд 1-метилникотинамид (MNA)-ээр нилээд баяжуулагдаһан байдаг. Т эсүүдэй МНА-гай хэмжээн үндэршье һаа, никотинамид N-метилтрансфераза (S-аденозилметионинһаа никотинамид руу метил бүлэгүүдэй дамжуулалтые катализатор болгодог фермент)-эй илгарал фибробластууд болон хабдарай эсүүдтэ хизаарлагдадаг. Үйлэдэлэй талаар МНА Т эсүүдые хабдар үүсхэгшэ цитокин хабдарай үхэлэй фактор альфа шэлжүүлхэ болгодог. Тиимэһээ TME-һээ гаралтай MNA Т эсэй дархалалай зохисуулгада хубита оруулдаг ба хүнэй хорото хабдар эмшэлхэ боломжотой иммунотерапиин зорилго болоно.
Хабдарһаа гаралтай метаболитууд хабдарай эсрэг дархалалай гүнзэгы дарангы нүлөө үзүүлдэг ба үбшэнэй үргэлжэлэлэй гол хүдэлгөөнэй хүсэн боложо шадаха тухай улам бүри олон баримтанууд харуулна (1). Варбургын нүлөөнһөө гадна, хабдарай эсэй бодосой солилсооной байдалые болон хабдарай микрооршоной (TME) дархалалай байдалтай холбоое тодорхойлхо һаяын ажал эхилһэн байна. Хулганануудай загбар болон хүнэй Т эсүүд дээрэ хэһэн шэнжэлэлнүүд глутамин бодосой солилсоо (2), исэлдэлтын бодосой солилсоо (3) ба глюкозой бодосой солилсоо (4) элдэб дархалалай эсэй дэд бүлэгүүдтэ бэеэ дааһан үйлэшэлжэ шададаг гэжэ харуулһан байна. Эдэ замуудта хэд хэдэн метаболитууд Т эсэй хабдарай эсрэг үйлэ ажаллалгые дарана. Кофермент тетрагидробиоптерин (BH4)-эй блокада Т эсэй үржэхэ ябасые гэмтээжэ болохо ба бэе махабадта BH4-эй нэмэгдэл CD4 ба CD8-аар зуучлагдаһан хабдарай эсрэг дархалалай харюуе нэмэгдүүлдэг гэжэ гэршэлэгдэһэн байна. Нэмэжэ хэлэхэдэ, кинуренинэй дархалалай нүлөөе BH4 (5) хэрэглэхэ замаар абарха аргатай. Изоцитрат дегидрогеназа (IDH) мутант глиобластомада энантиометаболическа (R)-2-гидроксиглутарат (R-2-HG) шүүрэл Т эсэй эдэбхижүүлгэ, үржэхэ ба цитолизэй үйлэ ажаллалгые дарана (6). Һаяхан гликолизэй дэд бүтээгдэхүүн болохо метилглиоксалые миелоид гаралтай даралта эсүүд үйлэдбэрилдэг ба метилглиоксалай Т эсэй дамжуулга эффектор Т эсэй үйлэ ажаллалгые даража шададаг гэжэ элирүүлэгдэһэн байна. Эмшэлгын үедэ метилглиоксалай саармагжуулга миелоидһаа гаралтай даралта эсэй (MDSC) үйлэ ажаллалгые дабажа, хулганануудай загбарта шалгаха пункт блокада эмнэлгэ синергетикээр дээшэлүүлжэ шадаха (7). Эдэ шэнжэлэлнүүд хамтадаа Т-эсэй үйлэ ажалалгаа ба үйлэ ажаллалгые зохисуулхада ТМЭ-һээ гаралтай метаболитуудай гол үүргэ онсолон тэмдэглэнэ.
Т эсэй үйлэ ажаллалгын алдагдалга умайн хүзүүгэй хорото хабдарта үргэнөөр мэдээлэгдэһэн байна (8). Энэнь зарим талаараа гипокси болон хабдарай һудаһанай өөршэлэлтэ (9)-эй шэнжэтэй бодосой солилсооной шэнжэ шанарһаа болоно, энэнь глюкоза ба триптофан һүнэй хүшэлтүрэгшэ ба кинуренин гэхэ мэтэ дэд бүтээгдэхүүн болгон хубилдаг. Хэтэрмэ эсһээ гадуурхи лактат интерферон-γ (IFN-γ) үйлэдбэрилэлые багадхажа, миелосупрессивна дэд бүлэгүүдэй илгаралые хүтэлбэрилдэг (10, 11). Триптофан хэрэглэлгэ Т эсэй үржэхэ ябасые шууд даража, Т эсэй рецепторой дохёо дамжуулалтые даража байна (12-14). Эдэ ажаглалтануудые хараад үзэхэдэ, дархалалай бодосой хубилалтын талаар ехэ ажал in vitro Т эсэй соёлдо оновчтой оршон хэрэглэн хэгдэһэн гү, али in vivo хулганануудай гомолог загбараар хизаарлагдаһан, эдэ хоёрой алинииньшье хүнэй хорото хабдарай гетерогенность болон физиологиин макро ба микро оршон тойронхиие дүүрэн харуулнагүй.
Умайн хүзүүгэй хорото хабдарай ниитэ шэнжэнь гэдэһэнэй тархалта ба асцитын бии бололго юм. Асцит соо эсэй шэнгэн суглархань үбшэнэй дэбжэлтэтэй, муу уридшалан мэдэгдэхэтэй холбоотой (15). Мэдээсэлэй ёһоор, энэ онсогой таһаг гипокситэй, һудаһанай эндотелиин ургалтын фактор (VEGF) ба индоламин 2,3-диоксигеназа (IDO) үндэр хэмжээтэй, Т-зохисуулагша эсүүд болон миелоид дарангылагша эсүүдээр нэбтэрһэн (15-18). Асцитын бодосой солилсооной оршон хабдарай өөрһөө илгаатай байжа болоно, тиимэһээ гэдэһэ доторой Т эсэй дахин программировалга тодорхой бэшэ. Нэмэжэ хэлэхэдэ, хабдарай оршон соо байдаг асцит ба метаболит хоорондын гол илгаанууд ба гетерогенность дархалалай эсүүдэй нэбтэрэлгэ ба тэдэнэй хабдар дээрэхи үйлэ ажаллалгада һаад боложо магадгүй тула саашадаа шэнжэлэл хэхэ хэрэгтэй.
Эдэ асуудалнуудые шиидхэхэ зорилгоор бидэ нарин эсэй тусгаарлалта ба шэнгэн хроматографиин тандем масс-спектрометриин (LC-MS/MS) арга зохёожо, элдэб эсэй түхэлнүүдые (CD4 + ба CD8 + Т эсүүдые багтааһан) болон хабдарай дотор ба хоорондо шэнжэлһэн байнабди. Бидэ энэ аргые үндэр хэмжээнэй гүйдэлэй цитометри болон нэгэ эсэй РНК-гай дараалал (scRNA-seq)-тай хамта хэрэглэжэ, эдэ гол популяцинуудай бодосой солилсооной байдалай үндэр шиидхэбэритэй дүрсэ үгэнэбди. Энэ аргаар хабдарай Т эсүүдтэ 1-метилникотинамидай (MNA) хэмжээнэй үндэр хэмжээн нэмэгдэһэниие элирүүлһэн болоод in vitro туршалганууд MNA-гай Т эсэй үйлэ ажаллалгада үзүүлхэ иммуномодулятор нүлөө урид мэдэгдээгүй байһаниие харуулһан байна. Юрэнхыдөө, энэ арга хабдар ба дархалалай эсүүдэй хоорондохи харилсан үйлэшэлэлые элирүүлдэг ба дархалалай зохисуулха метаболитууд тухай онсогой ойлгосо үгэнэ, энэнь Т эс дээрэ үндэһэлһэн умайн хүзүүгэй хорото хабдарай иммунотерапии эмшэлхэ хэрэгсэлдэ туһатай байжа болоно. Эмшэлгын арга боломжонууд.
Бидэ глюкозын абалга [2-(N-(7-нитрофенил-2-окса-1,3-диаза-4-ил)амино)-2-дезоксиглюкоза (2-NBDG) ба митохондриин үйлэ ажаллалгые [MitoTracker Deep Red (MT DR)] (2019) дархалалай эсүүдые ба хабдарай эсэй популяцинуудые илгаруулдаг еһотой тэмдэгүүд (S2 таблица ба S1A зураг). Энэ шэнжэлэлгын дүнгөөр ​​Т эсүүдтэй харисуулхада, асцит ба хабдарай эсүүд глюкозын абалга үндэр хэмжээтэй, харин митохондриин үйлэ ажаллалгын илгаа багатай байдаг. Хабдарай эсэй дунда зэргын глюкозын абалга [CD45-EpCAM (EpCAM)+] Т эсэйхиһээ гурба-дүрбэн дахин ехэ, CD4 + Т эсэй дунда зэргын глюкозын абалга CD8 + Т эсэйхиһээ 1.2 дахин ехэ, энэнь хабдарай нэбтэрһэн лимфоцитууд (TIL) адли TAME-дэшье өөр өөр бодосой солилсооной эрилтэтэй байдагые харуулна (Зураг 1). Харин хабдарай эсүүдэй митохондриин үйлэ ажалалгаа CD4 + Т эсүүдтэй адлирхуу, хоёр түрэлэй эсэй митохондриин үйлэ ажалалгаа CD8 + Т эсүүдэйхиһээ үндэр (Зураг 1В). Юрэнхыдөө, эдэ дүнгүүд бодосой солилсооной хэмжээе элирүүлнэ. Хабдарай эсэй бодосой солилсооной эдэбхи CD4 + Т эсэйхиһээ үндэр, CD4 + Т эсэй бодосой солилсооной эдэбхи CD8 + Т эсэйхиһээ үндэр. Эсэй янзануудай хоорондо иимэ нүлөө үзүүлһэншье һаа, хабдартай харисуулхада CD4 + ба CD8 + Т эсэй бодосой солилсооной байдал гү, али асцитын харисангы хубидань тогтомол илгаа үгы (Зураг 1С). Харин CD45-эсэй фракцида хабдарта EpCAM+ эсэй хуби асциттай харисуулхада нэмэгдэһэн байна (Зураг 1D). Мүн EpCAM+ ба EpCAM- эсэй бүридүүлэгшэ хоорондын тодорхой бодосой солилсооной илгаа ажаглаабди. EpCAM+ (хабдар) эсүүд EpCAM- эсүүдһээ глюкозын абалга ба митохондриин эдэбхитэй байдал ехэтэй, энэнь TME-дэхи хабдарай эсүүдэй фибробластуудай бодосой солилсооной эдэбхитэй байдалһаа хамаагүй үндэр (Зураг 1, E ба F).
(А ба В) Глюкозын абалга (2-NBDG) (А) ба CD4 + Т эсэй митохондриин үйлэ ажалалгаа (MitoTracker хара улаан) дунда зэргын флуоресценциин эршэм (MFI) (Б) Түлөөлэгшэ графигууд (зүүн) ба таблицаар үгтэһэн мэдээсэл (Баруун), CD8 + Т эсүүд ба EpCAM + CD45-хабдарай эсүүд ба хабдарай эсүүд ба хабдарай эсүүд. (C) Асцит ба хабдарта CD4 + ба CD8 + эсүүдэй (CD3 + Т эсүүдэй) харисаа. (D) Асцит ба хабдарта EpCAM + хабдарай эсэй хуби (CD45−). (E ба F) EpCAM + CD45-хабдар ба EpCAM-CD45-матрица глюкозын абалга (2-NBDG) (E) ба митохондриин үйлэ ажалалгаа (MitoTracker хара улаан) (F) түлөөлхэ графигууд (зүүн) ба таблицатай мэдээсэл (Баруун) Асцит ба хабдарай эсүүд. (G) CD25, CD137 ба PD1 илгаралгын түлөөлһэн графигууд гүйдэлэй цитометриин аргаар. (H ба I) CD25, CD137 ба PD1 CD4 + Т эсүүд дээрэ илгарал (H) ба CD8 + Т эсүүд (I). (J ба K) CCR7 ба CD45RO-гай илгарал дээрэ үндэһэлһэн гэнэн, түб дурсамжа (Tcm), эффектор (Teff) ба эффектор дурсамжа (Tem) фенотипүүд. Асцит ба хабдарта CD4 + Т эсүүдэй (J) ба CD8 + Т эсүүдэй (K) түлөөлһэн зурагууд (зүүн) ба таблицаар үгтэһэн мэдээсэл (баруун). P сэнгүүдые хос t-тестээр тодорхойлһон (*P<0.05, **P<0.01 ба ***P<0.001). Энэ шугам таарһан үбшэнтэниие (n = 6) харуулна. FMO, флуоресценци хасаха нэгэ; MFI, дунда зэргын флюоресценциин эршэм хүсэн.
Саашадаа шэнжэлэлгэ үндэр шиидхэгдэһэн Т эсэй фенотипическэ байдалай хоорондохи бусад удха шанартай илгаануудые элирүүлһэн байна. Хабдарта эдэбхижүүлһэн (Зураг 1, G-һээ I хүрэтэр) ба эффектор дурсамжа (Зураг 1, J ба K) асцитһаа (CD3 + Т эсэй хуби) хамаагүй олон ушардаг. Үшөө тиихэдэ, эдэбхижүүлгын тэмдэглэгшэдэй (CD25 ба CD137) ба хомордохо тэмдэглэгшэдэй [программированна эсэй үхэлэй уураг 1 (PD1)] илгаралаар фенотипые шэнжэлхэдээ, эдэ популяцинуудай бодосой солилсооной шэнжэ шанарнууд ондо ондоошье һаа (Зураг S1, B-һээ E хүрэтэр), Гэбэшье дурсамжын гү, али дурсамжын дэд бүлэгэй хоорондо удха шанартай бодосой солилсооной илгаанууд тогтомол ажаглагдаагүй (Зураг S1, F1) БИ). Эдэ дүнгүүдые эсэй фенотипүүдые автоматаар тодорхойлхын тулада машинаар һуралсалай арга хэрэглэн баталаа (21), энэнь үбшэнтэнэй асцит соо олон тооной яһанай чөмөгэй эсүүдэй (CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO +) байһые элирүүлһэн байна (Зураг S2A ). Бүхы элирүүлэгдэһэн эсэй түхэлнүүдэй дунда энэ миелоид эсэй популяци эгээл ехэ глюкозын абалга ба митохондриин эдэбхитэй байдалые харуулһан байна (Зураг S2, B-һээ G хүрэтэр). Эдэ дүнгүүд HGSC үбшэнтэнэй асцит ба хабдарта олоһон олон эсэй түхэлнүүдэй хоорондохи бодосой солилсооной хүсэтэй илгаае онсолон тэмдэглэнэ.
TIL-эй метабономическа шэнжэ шанарые ойлгоходо гол бэрхэшээл хадаа хабдарһаа хангалтатай арюун, шанартай, тоотой Т эсэй дээжые тусгаарлаха хэрэгтэй болоно. Һүүлшын шэнжэлэлнүүдэй дүнгөөр ​​гүйдэлэй цитометри дээрэ үндэһэлһэн илгарал ба шүрэ баяжуулгын арганууд эсэй метаболит профильда хубилалтануудые оруулха аргатай (22-24). Энэ асуудалые дабахын тулада бидэ LC-MS/MS-ээр шэнжэлхэһээ урид хирургиин аргаар һалгаһан хүнэй умайн хүзүүгэй хорото хабдарһаа TIL-ые тусгаарлаха ба тусгаарлаха шүрэ баяжуулгын арга оностой болгообди (Материал ба аргануудые харагты; Зураг 2А). Энэ протоколай метаболит хубилалтада үзүүлһэн ниитэ нүлөөе сэгнэхэ зорилгоор бидэ дээрэхи шүрэ илгаруулха шатаһаа хойшо элүүр донорнуудай эдэбхижүүлһэн Т эсэй метаболит профильнуудые шүрэ илгаруулагдаагүй, харин мүльһэн дээрэ үлэһэн эсүүдтэй зэргэсүүлээбди. Энэ шанар шалгаха шэнжэлэлгын дүнгөөр ​​эдэ хоёр байдалай хоорондо үндэр холбоо бии (r = 0.77), 86 метаболит бүлэгэй техническэ дабтагдаха шадабаринь үндэр дабтагдаха шадабаритай (Зураг 2В). Тиимэһээ эдэ арганууд эсэй түхэлэй баяжуулгада орожо байһан эсүүдтэ зүб метаболит шэнжэлэл хэжэ шадаха, тиигэжэ HGSC-дэхи тусхай метаболитнуудые элирүүлхэ түрүүшын үндэр нягта платформые үгэжэ, тиигэжэ хүнүүдтэ эсэй онсогой байдалые гүнзэгыгөөр ойлгохо боломжо олгоно Бэлгын бодосой солилсооной программа.
(А) Соронзон шүрэ баяжуулгын схемээр зураг. LC-MS/MS-ээр шэнжэлхын урда тээ эсүүд гурбан удаа дараалан соронзон шүрэ баяжуулха гү, али мүльһэн дээрэ үлэхэ. (B) Метаболитнуудай элбэг байдалда баяжуулгын түхэлэй нүлөө. Баяжуулгын түхэл бүхэндэ гурбан хэмжүүрэй дунда зэргые ± SE. Саарал зурлаа 1:1 харилсаае харуулна. Түхэреэн тэмдэгтэ харуулагдаһан дабтагдаһан хэмжүүрэй анги доторхи харилсаан (ICC). NAD, никотинамид аденин динуклеотид. (C) Үбшэнтэнэй метаболит шэнжэлэлгын ажалай урсалга тухай схемэтэ зураг. Асцит гү, али хабдарые үбшэнтэнһөө суглуулжа, криоконсерваци хэнэ. Дээжын багахан хубиие гүйдэлэй цитометриин аргаар шэнжэлһэн болобошье үлэһэн дээжые CD4+, CD8+ ба CD45- эсүүдэй баяжуулгын гурбан ээлжээндэ үнгэргэһэн байна. Эдэ эсэй фракцинуудые LC-MS/MS хэрэглэн шэнжэлһэн байна. (D) Стандартизацилагдаһан метаболит элбэг байдалай дулаанай карта. Дендрограмма дээжэнүүдэй хоорондохи Евклидай зайе Уордын бүлэглэлые харуулна. (E) Дээжын метаболит картын гол бүридүүлэгшын шэнжэлэл (PCA), дээжэ бүхэнэй гурбан дабталга харуулһан, нэгэ үбшэнтэнэй дээжые шугамаар холбоһон байна. (F) Үбшэнтэндэ тааруулагдаһан дээжэ метаболит профилиин PCA (т.е. хэһэг хубиин үлүү хэрэглэжэ); дээжэ түхэл дүхэриг бэеһээ хизаарлагдана. PC1, гол бүридүүлэгшэ 1; PC2, гол бүридүүлэгшэ 2.
Удаань, бидэ энэ баяжуулгын арга хэрэглэн, зургаан HGSC үбшэнтэнэй анханай асцит ба хабдарта CD4 +, CD8 + ба CD45-эсэй фракцинуудай 99 метаболит шэнжэлээбди (Зураг 2С, Зураг S3A ба таблица S3 ба S4). Һонирхолтой популяци амиды эсэй анханай томо дээжэһээ 2%-һаа 70% хүрэтэр эзэлдэг ба эсэй хубинь үбшэнтэнэй хоорондо ехээр илгаатай байдаг. Бүрсэгүүдые тусгаарлаһанай удаа, һонирхолтой баяжуулһан хуби (CD4+, CD8+ гү, али CD45-) дунда зэргээр дээжэ соохи бүхы амиды эсүүдэй 85%-һаа дээшэ болоно. Энэ баяжуулгын арга хадаа хүнэй хабдарай эдэй бодосой хубилалтын эсэй популяцинуудые шэнжэлхэ боломжо олгодог, энэнь томо дээжэһээ хэхэ аргагүй. Энэ протоколые хэрэглэн, бидэ l-кинуренин ба аденозин, эдэ хоёр һайн шэнжэтэй иммунодепрессивна метаболитууд хабдарай Т эсүүдтэ гү, али хабдарай эсүүдтэ нэмэгдэһэн гэжэ тодорхойлбобди (Зураг S3, B ба C). Тиимэһээ эдэ дүнгүүд манай эсэй илгарал ба масс-спектрометриин технологиин үнэн сэхэ байдалые ба үбшэнтэнэй эд эстэ биологиин шухала метаболитуудые олохо шадабариие харуулна.
Манай шэнжэлэлгэ үбшэнтэнэй дотор ба хоорондохи эсэй түхэлнүүдэй хүсэтэй бодосой солилсооной илгарал элирүүлһэн байна (Зураг 2D ба Зураг S4A). Тодорхойгоор хэлэбэл, бусад үбшэнтэнтэй харисуулхада, 70-дахи үбшэнтэн ондо ондоо бодосой солилсооной шэнжэ шанартай байгаа (Зураг 2Е ба Зураг S4B), энэнь үбшэнтэнэй хоорондо бодосой солилсооной үндэр хэмжээнэй илгарал байжа болохо гэжэ харуулна. Бусад үбшэнтэнтэй (1.2-һоо 2 литр хүрэтэр; S1 таблица) харисуулхада, 70-дахи үбшэнтэнэй (80 мл) асцитын ниитэ хэмжээн бага байгаа гэжэ тэмдэглэхэ шухала. Гол бүридүүлэгшын шэнжэлэлгын үедэ үбшэнтэн хоорондын гетерогенностьые хянаха (жэшээнь, хэһэг хубиин шэнжэлэлые хэрэглэхэ) эсэй янзануудай хоорондохи тогтомол хубилалтануудые харуулна, эсэй янзанууд ба/гү, али микрооршон метаболит профиль ёһоор тодорхойгоор суглуулагдаһан байна (Зураг 2F ). Нэгэ метаболит шэнжэлэл эдэ нүлөөнүүдые онсолон тэмдэглэжэ, эсэй янзанууд болон микрооршон хоорондын удха шанартай илгаануудые элирүүлһэн байна. Эгээл ехэ илгаа хадаа MNA гэжэ тэмдэглэхэ шухала, энэнь ехэнхидээ CD45- эсүүдтэ ба хабдарта нэбтэрһэн CD4+ ба CD8+ эсүүдтэ баяжуулагдадаг (Зураг 3А). CD4 + эсүүдтэ энэ нүлөө эгээл эли тодо, CD8 + эсүүдэй MNA оршон тойронхи байгаалиһаа ехээр нүлөөлдэг шэнги. Гэбэшье, энэнь шухала бэшэ, юундэб гэхэдэ зургаан үбшэнтэнэй гансал гурбыень хабдарай CD8+ сэгнэлтээр сэгнэжэ болоно. MNA-һаа гадна, асцит ба хабдарай элдэб янзын эсүүдтэ TIL-дэ муугаар тодорхойлогдоһон бусад метаболитууд баһал илгаатай баян байдаг (S3 ба S4 зурагууд). Тиимэһээ эдэ мэдээнүүд саашадаа шэнжэлхэ ухаанай иммуномодуляторна метаболитнуудай найдамтай багтаамжа элирүүлнэ.
(A) Асцит ба хабдарһаа CD4+, CD8+ ба CD45- эсүүдэй MNA-гай нормализацилагдаһан агууламжа. Хабтагай зураг дээрэ дунда зэргые (шугам), дүрбэлжэн хоорондын диапазон (рамкын нугаһан) ба мэдээсэлэй диапазон харуулна, дүрбэлжэн хоорондын диапазонһоо (хүреэнэй һүүл) 1.5 дахин ехэ. Үбшэнтэнэй материал ба аргануудта тодорхойлһон ёһоор, үбшэнтэнэй лиммын сэн хэрэглэн, Р сэн тодорхойлно (*P<0.05 ба **P<0.01). (B) MNA бодосой солилсооной схемэтэ зураг (60). Метаболитууд: S-аденозил-1-метионин; SAH, S-аденозин-1-гомоцистеин; NA, никотинамид; МНА, 1-метилникотинамид; 2-PY, 1-метил- 2-пиридон-5-карбоксамид; 4-PY, 1-метил-4-пиридон-5-карбоксамид; NR, никотинамид рибоза; NMN, никотинамид мононуклеотид. Ферментнүүд (ногоон): NNMT, никотинамид N-метилтрансфераза; SIRT, сиртуинууд; NAMPT, никотинамид фосфорибозил трансфераза; AOX1, альдегид оксидаза 1; NRK, никотинамид рибозид киназа; NMNAT, никотинамид моно Нуклеотид аденилат трансфераза; Pnp1, пурин нуклеозид фосфорилаза. (C) t-SNE scRNA-seq асцит (саарал) ба хабдар (улаан; n = 3 үбшэнтэн). (D) scRNA-seq хэрэглэн тодорхойлһон элдэб эсэй популяцинуудта NNMT илгарал. (E) SK-OV-3, хүнэй үрэ хүүгэдэй бөөрэ (HEK) 293T, Т эсүүд болон MNA-ээр эмшэлһэн Т эсүүдтэ NNMT ба AOX1-эй илгарал. Нугалһан илгарал SK-OV-3-тай харисуулан харуулагдана. SEM-тэй илгаралгын хэб маяг харуулагдана (n = 6 элүүр донорнууд). Ct-эй 35-һаа ехэ сэн элирүүлэгдэхэгүй (UD) гэжэ тоосогдодог. (F) SLC22A1 ба SLC22A2-эй SK-OV-3, HEK293T, Т эсүүд болон 8мМ МНА-тай эмшэлһэн Т эсүүдтэ илгарал. Нугалһан илгарал SK-OV-3-тай харисуулан харуулагдана. SEM-тэй илгаралгын хэб маяг харуулагдана (n = 6 элүүр донорнууд). Ct-эй 35-һаа ехэ сэн элирүүлэгдэхэгүй (UD) гэжэ тоосогдодог. (G) MNA-тай 72 часай туршада инкубаци хэһэнэй һүүлдэ эдэбхижүүлһэн элүүр донор Т эсүүдэй эсэй MNA-гай агууламжа. SEM-тэй илгаралгын хэб маяг харуулагдана (n = 4 элүүр донорнууд).
MNA никотинамид N-метилтрансферазаар (NNMT; Зураг 3В) S-аденозил-1-метионин (SAM)-һаа никотинамид (NA)-да метил бүлэгые дамжуулан бии болодог. NNMT хүнэй олон янзын хорото хабдарта үлүү ехээр илгаруулагдадаг ба үржэхэ, нэбтэрхэ, метастазтай холбоотой (25-27). TME-дэхи Т эсүүдэй MNA-гай эхи үүсхэлые һайнаар ойлгохын тулада бидэ гурбан HGSC үбшэнтэнэй асцит ба хабдарта эсэй янзануудаар NNMT-эй илгарал тодорхойлхын тулада scRNA-seq хэрэглээбди (Хүснэгтэ S5). Ойролсоогоор 6,500 эсэй шэнжэлэлгын дүнгөөр ​​асцит ба хабдарай оршон байдалда NNMT илгарал фибробласт ба хабдарай эсэй популяцинуудта хизаарлагдаһан байгаа (Зураг 3, С ба D). PTPRC (CD45 +) илгаруулдаг ямаршье популяцида NNMT илгарал үгы гэжэ тэмдэглэхэ шухала (Зураг 3D ба Зураг S5A), энэнь метаболит спектрдэ элирүүлһэн MNA Т эсүүдтэ нэбтэрүүлэгдэһэн гэжэ харуулна. Альдегид оксидаза 1 (AOX1)-эй илгарал MNA-ые 1-метил-2-пиридон-5-карбоксамид (2-PYR) гү, али 1-метил-4-пиридон-5-карбоксамид (4- PYR) болгодог; Зураг 3B) мүн COL1A1 илгаруулдаг фибробластуудай популяцида хизаарлагдаһан (Зураг S5A), эдэ бүгэдэ хамтадаа Т эсүүдэй заншалта MNA солилсооной шадабаригүй байһые харуулна. Эдэ MNA-тай холбоотой генүүдэй илгаралгын хэб маягые HGSC үбшэнтэнэй асцитһаа хоёрдохи бэеэ дааһан эсэй мэдээсэлэй багтаамжа хэрэглэн шалгаһан байна (Зураг S5B; n = 6) (16). Нэмэжэ хэлэхэдэ, MNA-ээр эмшэлһэн элүүр донор Т эсүүдэй тоогой полимеразын гинжын харюу (qPCR) шэнжэлэлгын дүнгөөр ​​SK-OV-3 умайн хүзүүгэй хабдарай эсүүдтэй харисуулхада NNMT гү, али AOX1 бараг илгардаггүй байгаа (Зураг 3Е). Эдэ хүлеэгдээгүй дүнгүүд MNA фибробластуудһаа гү, али хабдарһаа TME-дэхи зэргэлээд байһан Т эсүүдтэ шэлжүүлэгдэжэ магадгүй гэжэ харуулна.
Хэдыгээр кандидатнуудта уһалдаг 22 (SLC22) бүлэг (SLC22A1, SLC22A2 ба SLC22A3) кодлогдоһон органическа катион дамжуулагшадай 1-һээ 3 хүрэтэрхи бүлэг (OCT1, OCT2 ба OCT3) ородогшье һаа, MNA-гай боломжотой дамжуулагшад тодорхойлогдоогүй байна (28) . Элүүр энхэ донор Т эсэй мРНК-гай QPCR SLC22A1-эй илгаралгын бага хэмжээе харуулһан болобошье SLC22A2-эй илгаралгүй хэмжээе харуулһан, энэнь урид уран зохёолдо тэмдэглэгдэһэниие баталһан (Зураг 3F) (29). Харин SK-OV-3 умайн хүзүүгэй хабдарай эсэй шугам хоёр транспортёрой үндэр хэмжээе илгаруулһан байна (Зураг 3F).
Т эсүүдэй хариин МНА шэнгээхэ шадабаритай байха боломжые туршаха зорилгоор элүүр донор Т эсүүдые МНА-гай ондо ондоо концентрацитай 72 часай туршада үржүүлһэн байна. Экзогеннэ МНА үгы байхада МНА-гай эсэй агуулга элирүүлэгдэхэгүй (Зураг 3G). Гэбэшье, экзогеннэ МНА-аар эмшэлһэн эдэбхижүүлһэн Т эсүүд эсүүдэй МНА-гай агууламжа 6 мМ МНА хүрэтэр тунһаа дулдыдаха нэмэгдэл харуулһан байна (Зураг 3G). Энэ дүнгөөр ​​транспортёрой илгарал бага, эс доторхи МНА-гай бодосой солилсоондо харюусаха гол фермент үгышье һаа, ТИЛ МНА-ые абажа шададаг гэжэ харуулна.
Үбшэнтэнэй Т эсүүдэй метаболитуудай спектр болон in vitro MNA шэнгээхэ туршалганууд хорото хабдартай холбоотой фибробластууд (CAF) MNA шүүрэл гаргаха боломжые нэмэгдүүлдэг ба хабдарай эсүүд TIL-эй фенотип болон үйлэ ажаллалгые зохисуулха аргатай. МНА-гай Т эсүүдтэ үзүүлхэ нүлөөе тодорхойлохын тулада элүүр донор Т эсүүдые МНА-гай байгаа гү, али үгы байхада in vitro эдэбхижүүлжэ, тэдэнэй үржэхэ, цитокин үйлэдбэрилэлые сэгнэһэн байна. Эгээл ехэ тунгаар МНА нэмэһэнэй 7 хоногой һүүлдэ хүн зоной хоёр дахин нэмэгдэхэ тоо дунда зэргээр багадхаһан болобошье бүхы тунгаар эршэ хүсэн хадгалагдаһан байна (Зураг 4А). Нэмэжэ хэлэхэдэ, экзогеннэ МНА-гай эмшэлгэ хадаа хабдарай үхэлэй фактор-α (TNFα; Зураг 4В) илгаруулдаг CD4 + ба CD8 + Т эсүүдэй хубиие нэмэгдүүлһэн байна. Харин CD4 + Т эсүүдтэ IFN-γ-эй эс доторхи үйлэдбэрилэл ехээр буурһан, харин CD8 + Т эсүүдтэ үгы, интерлейкин 2-до үндэр хубилалта үгы байгаа (IL-2; Зураг 4, C ба D). Тиимэһээ эдэ MNA-ээр эмшэлһэн Т эсэй культурын супернатантнуудай ферменттэй холбоотой иммуносорбент шэнжэлэл (ELISA) TNFα-гай үндэр нэмэгдэл, IFN-γ-эй бууралга, IL-2-эй хубилалтагүй байһые харуулһан байна (Зураг 4, E-һээ G хүрэтэр). . IFN-γ-эй бууралга MNA Т эсэй хабдарай эсрэг үйлэ ажаллалгые дараха үүргэтэй байжа болохо гэжэ харуулна. Т эсэй зуучлагдаһан цитотоксичность дээрэ МНА-гай нүлөөе дууряаха зорилгоор ногоон флуоресцентнэ уураг (GFP) -CAR-T) эсүүдээр зохисуулагдадаг фолатын рецептор α ба CAR-T (GFP) руу зорюулһан химернэ антигенэй рецептор Т (FRα-CAR-T) эсүүдые элүүр донорой захын шуһанай мононуклеар эсүүд (PBMC) үйлэдбэрилдэг. CAR-T эсүүдые MNA-тай хамта 24 часай туршада үрэжүүлһэн, удаань хүнэй SK-OV-3 умайн хүзүүгэй хабдарай эсүүдтэй фолат рецептор α илгаруулдаг 10:1 эффектор ба зорилгын харисаагаар хамта үрэжүүлһэн байна. MNA эмшэлгэ FRα-CAR-T эсэй алаха үйлэ ажаллалгые ехээр бууруулжа, аденозиноор эмшэлһэн FRα-CAR-T эстэй адли байгаа (Зураг 4H).
(A) 7-дохи үдэртэ ниитэ амидаралтай эсэй тоо ба популяциин хоёр дахин нэмэгдэлгэ (PD) шууд үрэжүүлгэһээ. Бар график зургаан элүүр донорой дунда зэргые + SEM харуулна. Ядахадаа n = 3 бэеэ дааһан туршалгануудай мэдээсэлые харуулна. (B to D) CD3/CD28 ба IL-2 7 хоногой туршада тус тусдаа MNA концентрацида Т эсүүдые эдэбхижүүлхын тулада хэрэглэгдээ. Шэнжэлэлгын урда тээ эсүүдые 4 часай туршада GolgiStop-тай PMA/ionomycin-ээр эдэбхижүүлһэн байна. Т эсүүдтэ TNFα (B) илгарал. Амида эсүүдэй TNFα илгаралгын жэшээ зураг (зүүн) ба таблицаар үгтэһэн мэдээсэл (баруун). Т эсүүдтэ IFN-γ (C) ба IL-2 (D) илгарал. Цитокинуудай илгарал гүйдэлэй цитометриин аргаар хэмжэгдэһэн байна. Бар график дунда зэргые (n = 6 элүүр донорнууд) + SEM харуулна. Р сэн тодорхойлхын тулада дисперсиин нэгэ тээшээ шэнжэлэл ба дабтагдаһан хэмжээнүүдые (*Р<0.05 ба **Р<0.01) хэрэглэхэ. Ядахадаа n = 3 бэеэ дааһан туршалгануудай мэдээсэлые харуулна. (E to G) CD3/CD28 ба IL-2 7 хоногой туршада тус тусдаа MNA концентрацида Т эсүүдые эдэбхижүүлхын тулада хэрэглэгдээ. Оршон PMA/иономицин эдэбхижүүлгын 4 часай урда ба һүүлдэ суглуулагдаһан байна. TNFα (E), IFN-γ (F) ба IL-2 (G)-эй концентрацинуудые ELISA-гаар хэмжэжэ үзэбэ. Бар график дунда зэргые (n = 5 элүүр донорнууд) + SEM харуулна. P сэн дисперсиин нэгэ тээшээ шэнжэлэл ба дабтагдаһан хэмжүүрнүүдые хэрэглэн тодорхойлогдоһон (*P<0.05). Точкотой зурлаа илгаруулгын илгаруулгын хизаарые харуулна. (H) Эсэй лизисэй шэнжэлэл. FRα-CAR-T гү, али GFP-CAR-T эсүүдые 24 часай туршада аденозин (250μM) гү, али MNA (10 мМ)-ээр тааруулһан гү, али эмшэлүүлээгүй (Ctrl) орхиһон байна. SK-OV-3 эсэй үхэлэй хубиие хэмжэжэ үзэбэ. Уэлчын t тестээр тодорхойлогдоһон Р сэн (*Р<0.5 ба **Р<0.01).
MNA-һаа дулдыдаха TNFα илгарал зохисуулха тухай механизм ойлгохын тулада MNA-ээр эмшэлһэн Т эсэй TNFα мРНК-гай хубилалтануудые сэгнэһэн байна (Зураг 5А). MNA-ээр эмшэлһэн элүүр донор Т эсүүд TNFα транскрипциин хэмжээе хоёр дахин нэмэгдүүлһэниинь MNA TNFα транскрипциин зохисуулгаһаа дулдыдаха гэжэ харуулна. Энэ боломжотой зохисуулха механизмые шэнжэлхын тулада TNFα-ые зохисуулдаг хоёр мэдээжэ транскрипциин хүшэлтүрэгшэ, эдэбхижүүлһэн Т эсэй ядрогой хүшэлтүрэгшэ (NFAT) ба тусхай уураг 1 (Sp1), MNA-гай проксимальна TNFα промотортой холбогдохо харюу болгон сэгнэгдэһэн байна ( 30). TNFα промотор 6 тодорхойлогдоһон NFAT холбохо газарнуудые ба 2 Sp1 холбохо газарнуудые агуулдаг, нэгэ газарта дабхарладаг [5'cap-һаа -55 һуури хосууд (bp)] (30). Хроматин иммунопреципитаци (ChIP) MNA-тай эмшэлхэдэ Sp1-эй TNFα промотортой холбоо гурба дахин нэмэгдэһэн байна. NFAT-ые нэбтэрүүлгэ мүн лэ нэмэгдэжэ, шухала үүргэтэй болоо (Зураг 5B). Эдэ мэдээнүүд MNA Sp1 транскрипциин ашаар TNFα-гай илгаралые, бага хэмжээгээр NFAT-эй илгаралые зохисуулдаг гэжэ харуулна.
(A) MNAгүйгөөр үржүүлһэн Т эсүүдтэй харисуулхада, MNA-тай эмшэлһэн Т эсүүдэй TNFα илгаралгын хубилалта. SEM-тэй илгаралгын хэб маяг харуулагдана (n = 5 элүүр донорнууд). Ядахадаа n = 3 бэеэ дааһан туршалгануудай мэдээсэлые харуулна. (B) NFAT ба Sp1-эй һүүлдэ 8 мМ MNA-тай гү, али үгытэй эмшэлһэн Т-эсэй TNFα промоторые (Ctrl) ба PMA/иономицин эдэбхижүүлгэтэй 4 часай туршада хослуулаа. Иммуноглобулин G (IgG) ба H3 тус тусдаа иммунопреципитацида сүлөөтэ ба эерэг хяналтын шэнжэтэйгээр хэрэглэгдээ. ChIP-эй тоосоолол MNA-ээр эмшэлһэн эсүүдтэ Sp1 ба NFAT-ай TNFα промотортой холбоо хяналтын эсүүдтэй харисуулхада хэдэн дахин нэмэгдэһэн байна. Ядахадаа n = 3 бэеэ дааһан туршалгануудай мэдээсэлые харуулна. Олон t-тестээр тодорхойлогдоһон P сэн (*** P <0.01). (C) HGSC-эй асциттай харисуулхада, Т эсүүд (цитотоксик бэшэ) хабдарта TNF-эй илгарал нэмэгдэһэн байна. Үнгэнүүд ондо ондоо үбшэнтэниие харуулна. Харуулагдаһан нүхэнүүдые 300 хүрэтэр санамсаргүй дээжэ абажа, үлүү зуралга хизаарлахын тулада һэжэрһэн байна (** Padj = 0.0076). (D) Умайн хүзүүгэй хорото хабдарай MNA-гай дурадхагдаһан загбар. МНА хабдарай эсүүдтэ ба ТМЭ-дэхи фибробластуудта бии болодог ба Т эсүүдтэ абтадаг. MNA Sp1-эй TNFα промотортой холбоое нэмэгдүүлжэ, TNFα транскрипци болон TNFα цитокинай үйлэдбэрилэлые нэмэгдүүлдэг. MNA мүн IFN-γ-эй бууралтые үүсхэнэ. Т эсэй үйлэ ажаллалгые даралга алаха шадабариие бууруулжа, хабдарай ургалтые түргэдүүлдэг.
Мэдээсэлэй ёһоор, TNFα урда ба хойто талаһаа дулдыдаха хабдарай эсрэг ба хабдарай эсрэг нүлөөтэй, гэбэшье энэнь умайн хүзүүгэй хорото хабдарай ургалтые ба метастазуудые дэмжэхэ мэдээжэ үүргэтэй (31-33). Мэдээсэлэй ёһоор, умайн хүзүүгэй хорото хабдартай үбшэнтэнэй асцит ба хабдарай эдүүдтэ TNFα-гай концентраци һайн эдүүдтэй харисуулхада ехэ байдаг (34-36). Механизмын талаар TNFα сагаан шуһанай эсэй эдэбхижүүлгэ, үйлэ ажалалгаа, үржэлые зохисуулха, хорото хабдарай эсэй фенотипые хубилха аргатай (37, 38). Эдэ ололтуудтай тааруулан, дифференциальна генэй илгарал шэнжэлэлгын дүнгөөр ​​TNF хабдарай эдэй Т эсүүдтэ асциттай харисуулхада мэдэгдэхүйсэ дээшээ зохисуулагдаһан байна (Зураг 5С). TNF-эй илгарал нэмэгдэһэниинь гансал цитотоксик бэшэ фенотиптэй Т-эсэй популяцинуудта элирһэн байна (Зураг S5A). Тобшолол хэхэдээ, эдэ мэдээнүүд MNA HGSC-дэ дархалаа дарангылагша ба хабдар дэмжэхэ хоёр нүлөөтэй гэһэн үзэлые дэмжэнэ.
Урасхалай цитометри дээрэ үндэһэлһэн флуоресцентнэ тэмдэглэл TIL-эй бодосой солилсоое шэнжэлхэ гол арга болоһон байна. Эдэ шэнжэлэлнүүдэй дүнгөөр ​​захын шуһанай лимфоцитууд гү, али хоёрдохи лимфоид эрхэтэнүүдэй Т эсүүдтэй харисуулхада, хулгана ба хүнэй TIL глюкозые шэнгээхэ үндэр хандалгатай (4, 39) ба митохондриин үйлэ ажаллалгые аажамаар алдадаг (19, 40). Энэ шэнжэлэлгын адлирхуу дүнгүүдые ажаглаһаншье һаа, гол хүгжэлтэ хадаа хабдарай эсэй бодосой солилсоо болон нэгэ адли тайраһан хабдарай эдһээ TIL-ые зэргэсүүлхэ болоно. Эдэ урданай зарим мэдээсэлнүүдтэй тааруугаар, асцит болон хабдарһаа гаралтай хабдар (CD45-EpCAM +) эсүүд CD8 + ба CD4 + Т эсүүдһээ үлүү ехэ глюкозын абалгатай байдаг, энэнь хабдарай эсүүдэй үндэр глюкозын абалга Т эсүүдтэй зэргэсүүлжэ болохо гэжэ баталан харуулна. Т эсэй тэмсэлэй ойлгосо. ТМЭ. Гэбэшье хабдарай эсэй митохондриин эдэбхи CD8 + Т эсэйхиһээ үндэр, харин митохондриин эдэбхи CD4 + Т эсэйхитэй адли. Эдэ дүнгүүд исэлдэлтын бодосой солилсоо хабдарай эсүүдтэ шухала гэһэн шэнэ асуудалые баталан харуулна (41, 42). Тэдэ мүн CD8 + Т эсүүд CD4 + Т эсүүдһээ исэлдэлтын дисфункцида илүү мэдрэмтгий байжа болохо гү, али CD4 + Т эсүүд митохондриин үйлэ ажаллалгые хадгалхын тулада глюкозаһаа бусад нүүрһэнтүрэгшын эхи үүсэбэриие хэрэглэжэ болохо гэжэ дурадхана (43, 44). Асцит үбшэндэ CD4 + Т эффекторнууд, Т эффектор дурсамжа ба Т түб дурсамжа эсүүдэй хоорондо глюкозын абалга гү, али митохондриин үйлэ ажаллалгын илгаа ажаглаагүйбди гэжэ тэмдэглэхэ хэрэгтэй. Үүнтэй адли, хабдарта CD8 + Т эсэй дифференциациин байдал глюкозын абалга хубилалтада ямаршье холбоогүй, энэнь in vitro үрэжүүлһэн Т эсүүд болон in vivo хүнэй TIL хоорондохи удха шанартай илгаае онсолон тэмдэглэнэ (22). Эдэ ажаглалтануудые автомат эсэй популяциин хубаариие хэрэглэжэ баталаа, энэнь саашадаа CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO + эсүүд хабдарай эсүүдһээ үлүү глюкозын абалгатай ба митохондриин эдэбхитэй байдагые дэлгэрэнги болобошье Метаболическа эдэбхитэй эсэй популяцитай гэжэ элирүүлһэн байна. Энэ популяцинь scRNA-seq шэнжэлэлгын үедэ элирүүлһэн миелоид даралгын эсүүдэй гү, али плазмоцитоид дендрит эсүүдэй таамаг дэд популяциие түлөөлжэ магадгүй. Хэдыгээр эдэ хоюулаа хүнэй умайн хүзүүгэй хабдарта [45] тэмдэглэгдэһэншье һаа, тэдэ үшөөл хэрэгтэй. Энэ миелоид дэд популяциие тодорхойлхо талаар саашанхи ажал хэрэгтэй.
Хэдыгээр гүйдэлэй цитометри дээрэ үндэһэлһэн арганууд эсэй янзануудай хоорондохи глюкоза ба исэлдэлтын бодосой солилсооной ниитэ илгаае тодорхойлжо шададагшье һаа, ТМЭ-дэ митохондриин бодосой солилсоондо глюкоза гү, али бусад нүүрһэнтүрэгшын эхи үүсэбэриин үйлэдбэрилһэн нарин метаболитууд үшөө тодорхойлогдоогүй байна. Үгтэһэн TIL дэд бүлэгтэ метаболитнуудай бии гү, али үгые тодорхойлходо, тайраһан эдһээ эсэй популяциие арюудхаха хэрэгтэй. Тиимэһээ манай эсэй баяжуулгын арга масс-спектрометритэй хослуулан үбшэнтэнэй дээжэдэ Т эсүүд болон хабдарай эсэй популяцинуудта илгаатайгаар баяжуулагдаһан метаболитууд тухай ойлгосо үгэхэ аргатай. Энэ аргань флюоресценциин эдэбхижүүлһэн эсэй илгаралһаа илгаатайшье һаа, зарим метаболит номой сангууд үндэһэн тогтвортой байдал ба/гү, али түргэн эргэлтын хурдадхалһаа боложо нүлөөлжэ магадгүй (22). Гэбэшье, манай арга дээжэ янзануудай хоорондо ехээр илгардаг тула аденозин ба кинуренин гэһэн хоёр танигдаха иммунодепрессив метаболитые элирүүлжэ шадаа.
Хабдар ба TIL дэд түхэлнүүдэй манай метабономическа шэнжэлэл умайн хүзүүгэй TME-дэхи метаболитнуудай үүргэ тухай дэлгэрэнгы ойлгосо үгэнэ. Нэгэдэхеэр, гүйдэлэй цитометриие хэрэглэн, хабдар ба CD4 + Т эсүүдэй хоорондо митохондриин үйлэ ажаллалгын илгаа үгы гэжэ тодорхойлбобди. Гэбэшье, LC-MS/MS шэнжэлэл эдэ популяцинуудай дунда метаболитнуудай элбэг дэлбэг байдалда үндэр хубилалтануудые элирүүлһэниинь TIL-эй бодосой солилсоо болон тэрэнэй ниитэ бодосой солилсооной үйлэ ажалалгаа тухай тобшололнуудые нарин тайлбарилха хэрэгтэй гэжэ харуулна. Хоёрдохёор, MNA хадаа хабдар бэшэ, харин асцитын CD45-эсүүд ба Т-эсүүдэй хоорондо эгээл ехэ илгаатай метаболит юм. Тиимэһээ, таһаглал ба хабдарай байрлалга TIL-эй бодосой солилсоондо ондо ондоо нүлөө үзүүлжэ магадгүй, энэнь үгтэһэн микрооршоной боломжотой гетерогенностьые онсолон тэмдэглэнэ. Гурбадахяар, MNA үйлэдбэрилдэг NNMT ферментэй илгарал гол түлэб CAF-ээр хизаарлагдадаг, энэнь бага хэмжээгээр хабдарай эсүүд болоно, харин хабдарһаа гаралтай Т эсүүдтэ илгарха MNA хэмжээнүүд ажаглагдадаг. Умайн хүзүүгэй CAF-да NNMT-эй үлүү илгарал хорото хабдар үүсхэхэ нүлөөтэй гэжэ мэдээжэ, зарим талаараа CAF-эй бодосой солилсоо, хабдарай нэбтэрэлгэ ба метастазуудые дэмжэхэтэй холбоотой (27). TIL-эй ниитэ хэмжээн дунда зэргыншье һаа, CAF-дэхи NNMT-эй илгарал Cancer Genome Atlas (TCGA) мезенхимэй дэд түхэлтэй нягта холбоотой, энэнь муу уридшалан мэдэгдэхэтэй холбоотой (27, 46, 47). Һүүлдэнь, MNA-гай задаралые харюусаха AOX1 ферментэй илгарал мүн лэ CAF популяцида хизаарлагдадаг, энэнь Т эсүүд MNA-ые солилсохо шадабаригүй байһые харуулна. Эдэ дүнгүүд энэ ололтые баталхын тулада саашадаа ажал хэхэ хэрэгтэйшье һаа, Т эсүүдтэ MNA-гай үндэр хэмжээн иммунодепрессивна CAF микрооршон байгаае харуулжа магадгүй гэһэн бодолые дэмжэнэ.
MNA транспортёрнуудай илгаралгын бага хэмжээн ба MNA бодосой солилсоондо хабаатай гол уурагуудай элирүүлэгдэхэгүй хэмжээнүүдые хаража үзэхэдэ, Т эсүүдтэ MNA-гай байрлалга хүлеэгдээгүй. NNMT болон AOX1 хоёрые scRNA-seq шэнжэлэл болон хоёр бэеэ дааһан когортодо зорюулһан qPCR-ээр элирүүлжэ шадаагүй. Эдэ дүнгүүд MNA Т эсүүдээр синтезлэгдэдэггүй, харин оршон тойронхи TME-һээ шэнгэдэг гэжэ харуулна. In vitro туршалганууд Т эсүүд экзоген MNA суглуулха хандалгатай байдагые харуулна.
Манай in vitro шэнжэлэлнүүд экзогеннэ MNA Т эсүүдтэ TNFα-гай илгаралые үүсхэжэ, Sp1-эй TNFα промотортой холбоое нэмэгдүүлдэг гэжэ харуулаа. Хэдыгээр TNFα хабдарай эсрэг ба хабдарай эсрэг үүргэтэйшье һаа, умайн хүзүүгэй хорото хабдарта TNFα умайн хүзүүгэй хорото хабдарай ургалтые дэмжэжэ шадаха (31-33). Умайн хүзүүнай хабдарай эсэй соёлдо TNFα-ые саармагжуулха гү, али хулганануудай загбарта TNFα-гай дохёо усадхаха нь TNFα-зууршалһан үрэһэлэй цитокинай үйлэдбэрилэлые һайжаруулха ба хабдарай ургалтые дараха аргатай (32, 35). Тиимэһээ энэ ушарта TME-һээ гаралтай MNA аутокрин циклээр дамжуулан TNFα-һаа дулдыдаха механизмаар дамжуулан үрэһэл үүсхэгшэ метаболит боложо шадаха ба тиигэжэ умайн хүзүүгэй хорото хабдарай бии бололго ба тархалтые дэмжэнэ (31). Энэ арга боломжо дээрэ үндэһэлэн, TNFα блокада умайн хүзүүгэй хорото хабдарай эмнэлгын боломжотой бодос гэжэ шэнжэлэгдэжэ байна (37, 48, 49). Нэмэжэ хэлэхэдэ, MNA умайн хүзүүгэй хабдарай эсүүдтэ CAR-T эсэй цитотоксичностьые бууруулдаг, энэнь MNA-зууршалһан дархалалай даралга тухай нэмэлтэ баримта үгэнэ. Хамтадаа эдэ дүнгүүд хабдарнууд болон CAF эсүүдэй MNA-ые эсһээ гадуурхи TME-дэ шэлжүүлдэг загбарые дурадхана. (i) TNF-ээр үүсхэгдэһэн умайн хүзүүгэй хорото хабдарай ургалтын эдэбхижүүлгэ ба (ii) MNA-ээр үүсхэгдэһэн Т эсэй цитотоксик үйлэ ажаллалгые даралгаар энэнь хоёр хабдарай нүлөө үзүүлжэ магадгүй (Зураг 5D).
Түгэсхэлдэнь, түргэн эсэй баяжуулга, нэгэ эсэй дараалал ба бодосой солилсооной профиль хослуулан хэрэглэжэ, энэ шэнжэлэлгэ HGSC үбшэнтэнэй хабдар ба асцит эсэй хоорондохи иммунометаболомическа асари ехэ илгаае элирүүлһэн байна. Энэ үргэн шэнжэлэл Т эсүүдэй хоорондо глюкозын абалга ба митохондриин үйлэ ажаллалгын илгаанууд бии гэжэ харуулһан ба МНА-ые эсэй бэшэ автономито дархалалай зохисуулха метаболит гэжэ тодорхойлһон байна. Эдэ мэдээнүүд TME хүнэй хорото хабдарта Т эсэй бодосой солилсоондо ямар нүлөө үзүүлдэг бэ гэжэ нүлөөлнэ. Т эсүүд болон хорото хабдарай эсүүдэй хоорондохи тэжээлэй шууд тэмсэл тухай мэдээсэгдэһэншье һаа, метаболитууд хабдарай хүгжэлтые дэмжэхэ шууд бэшэ зохисуулагшаар үйлэшэлжэ, магадгүй эндоген дархалалай харюунуудые дараха аргатай. Эдэ зохисуулха метаболитнуудай үйлэ ажаллалгын үүргэ тухай саашадаа тодорхойлолто хабдарай эсрэг дархалалай харюуе дээшэлүүлхэ өөр стратегинуудые нээжэ магадгүй.
Үбшэнтэнэй дээжэ болон клиническэ мэдээсэлые Канадын эдэй сангай сүлжээнэй гэршэлһэн BC хорото хабдарай эдэй сангай ашаар абаһан байна. Британиин Колумбиин Хорт хабдарай шэнжэлэлгын ёһо зүйн хорооной болон Британиин Колумбиин Ехэ һургуулиин (H07-00463) баталһан протоколай ёһоор, бүхы үбшэнтэнэй дээжэ болон клиническэ мэдээсэлнүүд мэдээсэлтэй бэшэмэл зүбшөөл абаһан гү, али албан ёһоор зүбшөөлһөө арсаһан байна. Дээжынь гэршэлһэн Биобанкда (BRC-00290) хадагалагдана. Үбшэнтэнэй дэлгэрэнгы шэнжэ шанарнуудые S1 ба S5 таблицануудта харуулаа. Криопрезервацида скальпель хэрэглэн үбшэнтэнэй хабдарай дээжые механикаар задалжа, 100 микрон шүүгшэ дамжуулан түлхижэ нэгэ эсэй суспензи абадаг. Үбшэнтэнэй асцитые 1500 эргэлтэ/минутада 10 минутын туршада 4°C-та центрифугировалжа эсүүдые үрэжүүлжэ, дээдын шүүһые зайлуулһан байна. Хабдар ба асцитһаа абтаһан эсүүдые 50% дулаанаар эдэбхигүй болгоһон хүнэй AB ​​һүнэй сироп (Sigma-Aldrich), 40% RPMI-1640 (Thermo Fisher Scientific) ба 10% диметилсульфоксид соо криоконсерваци хэгдэһэн байна. Эдэ хадагалагдаһан нэгэ эсэй суспензинүүдые хайлуулжа, дооро тодорхойлһон метаболомик болон метаболит тодорхойлолтодо хэрэглэбэ.
Бүхы оршон 0.22 μm шүүһэн 50:50 нэмэгдэһэн RPMI 1640: AimV-һээ бүридэнэ. RPMI 1640 + 2.05 мМ l-глутамин (Thermo Fisher Scientific) 10% дулаанаар эдэбхигүй болгоһон хүнэй AB ​​һүн (Sigma-Aldrich), 12.5 мМ Hepes (Thermo Fisher Scientific), 2 мМ l-глутамин (Thermo Fisher Scientific) нэмэгдэһэн, x1 Пенициллин Стрептомицин (PenStrep) урасхал (Thermo Fisher Scientific) ба 50 мкМБ-меркаптоэтанол. AimV (Invitrogen) 20 мМ Hepes (Thermo Fisher Scientific) ба 2 мМ l-глутамин (Thermo Fisher Scientific) нэмэгдэнэ. Урдалай цитометрэй будалгын буфер 0.22μm шүүһэн фосфат буфертэй дабһатай (PBS; Invitrogen) 3% дулаанаар эдэбхигүй болгоһон AB хүнэй һүн (Sigma) нэмэгдэһэн байна. Эсэй баяжуулгын буфер 0.22μm шүүһэн PBS-һээ бүридэнэ ба 0.5% дулаанаар эдэбхигүй болгоһон хүнэй AB ​​һүнэй сироп (Sigma-Aldrich) нэмэгдэнэ.
37°C дүүрэн оршон соо эсүүдые 10 нМ МТ ДР ба 100 мкМ 2-НБДГ-ээр 30 минутын туршада будажа абаһан байна. Удаань эсүүдые 4°C-та 15 минутын туршада eF506 амидаралтай будагтай будажа абаһан байна. Эсүүдые FC Block (eBioscience) ба Brilliant Stain Buffer (BD Biosciences) соо дахин суспендироваад, гүйдэлэй цитометрэй будаха буфер соо шэлжүүлжэ (үйлэдбэрилэгшын заабариин ёһоор), 10 минутын туршада танхимай температурада инкубаци хэхэ. Эсүүдые 4°C-та 20 минутын туршада гүйдэлэй цитометриин будалгын буфер соо эсэргүү бодосуудай багтаамжаар (S2 таблица) будаха. Шэнжэлэлгын урда тээ эсүүдые гүйдэлэй цитометриин будалгын буфертэ (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R тохиргоо) дахин һэлгүүлхэ. Эсэй тоогой мэдээсэлые шэнжэлхын тулада SpectroFlo ба FlowJo V10 хэрэглэхэ, мэдээсэлые бүтээхэдээ GraphPad Prism 8 хэрэглэхэ. 2-NBDG ба MT DR-эй дунда зэргын флюоресценциин эршэм хүсэн (MFI) лог-нормализацилагдаһан, удаань таарһан үбшэнтэниие тоосохын тулада статистикын шэнжэлэл хэхэдээ хос t тест хэрэглэгдэһэн байна. Шэнжэлэлгын 40-һөө бага үйлэ ябадалтай бүхы популяцинуудые усадхаха; статистикын шэнжэлэл ба мэдээсэлэй үзэгдэл хэхэһээ урид ямаршье сүлөөтэ сэнгүүдтэ 1-эй MFI сэн оруулха.
Дээрэхи процессын панелэй гараар үүдэлгын стратегиие нэмэлтэ болгохын тулада бидэ FlowJo-до үхэһэн эсүүдые усадхаһанай һүүлдэ эсүүдые автоматаар популяцида үгэхэ зорилгоор хэлбэриин хизаарлалта модоор (FAUST) (21) дүүрэн аннотаци хэрэглээбди. Бидэ буруу хубаагдаһан шэнги үзэгдэдэг популяцинуудые (PD1+ PD1-хабдарай эсүүдтэй холбожо) ба үлэһэн популяцинуудые ниилүүлхын тулада гаралтые гараар ударидадагбди. Дээжэ бүхэндэ дунда зэргээр 2%-һаа дээшэ эсүүд бии, ниитэдээ 11 популяци.
PBMC-ые лейкоцит илгаруулха бүтээгдэхүүнһээ (STEMCELL Technologies) илгаруулхын тулада Фиколл градиент нягта центрифугированиие хэрэглэбэ. CD8 + Т эсүүдые CD8 MicroBeads (Miltenyi) хэрэглэн PBMC-һээ тусгаарлажа, үйлэдбэрилэгшын заабариин ёһоор TransAct (Miltenyi) хэрэглэн 2 долоон хоногой туршада бүрин оршондо үргэдхэбэ. Эсүүдые 5 хоногой туршада IL-7 (10 нг/мл; PeproTech) агуулһан дүүрэн оршондо байлгажа, удаань TransAct-ээр дахин эдэбхижүүлһэн байна. 7-дохи үдэр үйлэдбэрилэгшын заабариин ёһоор хүнэй CD45 MicroBeads (Miltenyi) гурбан удаа дараалан эсүүдые баяжуулхын тулада хэрэглэгдээ. Эсүүдые гүйдэлэй цитометриин шэнжэлэл хэхэдээ хубааһан (дээдэ талада тодорхойлһон ёһоор), нэгэ сая эсүүдые LC-MS/MS шэнжэлэл хэхэдээ гурба дахин хубааһан байна. Дээжые доро тодорхойлһон ёһоор LC-MS/MS аргаар болбосоруулһан байна. Бидэ 1000 ионой тоотойгоор дутуу метаболит сэнгые тоолообди. Дээжын бүхы ионой тоо (TIC)-ээр нормализацилагдажа, шэнжэлэлгын урда MetaboAnalystR-дэ логарифмээр хубилагдажа, автоматаар нормализацилагдана.
Үбшэнтэн бүхэнэй нэгэ эсэй суспензиие гэшхэжэ, 40 мкм шүүгшэ дамжуулан шүүжэ, бүрин оршон болгожо (дээдэ талада тодорхойлһон ёһоор) оруулһан байна. Үйлэдбэрилэгшын протоколой ёһоор, CD8+, CD4+ ба CD45- эсүүдэй дээжые (мүльһэн дээрэ) баяжуулхын тулада MicroBeads (Miltenyi) хэрэглэн соронзон шүрэ илгаруулха аргаар гурбан удаа дараалан эерэг шэлэн абалга хэрэглэбэ. Тобшохоноор хэлэбэл, эсүүдые эсэй баяжуулгын буфертэ (дээдэ зураглалаар) дахин суспендироваад тоолоно. Эсүүдые хүнэй CD8 шүрэнүүдтэй, хүнэй CD4 шүрэнүүдтэй гү, али хүнэй CD45 шүрэнүүдтэй (Miltenyi) 4°C-та 15 минутын туршада инкубаци хэжэ, удаань эсэй баяжуулгын буферээр угааба. Дээжые LS багана (Мильтеньи) дамжуулан, эерэг ба сүлөөтэ фракцинуудые суглуулна. Эсэй һэргээлтын алхамые бага болгожо, ехэ болгохын тулада CD8-фракциие CD4+ баяжуулгын хоёрдохи шатада хэрэглэжэ, CD4-фракциие удаадахи CD45-баяжуулгада хэрэглэнэ. Тусгаарлалгын бүхы ябасада уһаниие мүльһэн дээрэ байлгаха.
Метаболит шэнжэлэлгын дээжые бэлдэхэдээ, эсүүдые мүльһэн хүйтэн дабһанай уһанда нэгэ дахин угаагаад, дээжэ бүхэндэ 1 мл 80% метанол нэмэжэ, удаань шэнгэн азот соо һэлгүүлжэ, хүлдүүлһэн байна. Дээжые гурбан хүлдэхэ-таһалха циклдэ оруулһан ба 4°C-та 15 минутын туршада 14,000 эргэлтээр центрифугировалһан байна. Метаболитуудые агуулһан супернатант хатааха болотор ууршуулагдана. Метаболитнуудые 50 мкл 0.03% мэрээшэнэй хүшэлтүрэгшэдэ дахин уһалжа, холихын тулада һэлгүүлһэн, удаань хог хаягдалые зайлаха зорилгоор центрифугировалһан.
Дээрэ хэлэгдэһэнэй ёһоор метаболитнуудые гаргажа абагты. Супернатантые метаболомикын шэнжэлэлгын тулада үндэр гүйсэдхэлтэй шэнгэн хроматографиин лонходо шэлжүүлхэ. Партиин нүлөөнһөө һэргылхын тулада дээжэ бүхэниие адли тооной эсээр эмшэлхын тулада санамсаргүй эмшэлгын протокол хэрэглэхэ. Бидэ AB SCIEX QTRAP 5500 Triple Quadrupole Mass Spectrometer (50) дээрэ урид хэблэгдэһэн дэлхэйн метаболитнуудай шанарай сэгнэлтэ хээбди. Хроматографиин шэнжэлэл ба орьёлой талмайн интеграци MultiQuant 2.1 хубилалтатай программна хангамжа (Applied Biosystems SCIEX) хэрэглэн хэгдэһэн байна.
Дутуу метаболит сэнгые тодорхойлхын тулада 1000 ионой тоо хэрэглэгдээ, дээжэ бүхэнэй TIC-ые дээжые болбосоруулхаһаа инструментальна шэнжэлэлгын нэбтэрүүлһэн хубилалтануудые заһахын тулада илгарһан метаболит бүхэнэй нормализацилагдаһан орьёлой талмайе тоосоходо хэрэглэбэ. TIC-ые нормализацилһанай һүүлдэ, MetaboAnalystR(51) (үндэһэн параметр) логарифмическа хубилалтада ба автомат нормын шугамай масштабировалгада хэрэглэгдэдэг. Дээжын янзануудай хоорондохи метаболомой илгаануудые шэнжэлэлгын шэнжэлэл хэхэдээ, бидэ веган R багтаамжатай PCA хэрэглээбди, үбшэнтэниие шэнжэлхэдээ хэһэг хубиин үлүү шэнжэлэл хэрэглээбди. Дээжын хоорондохи Евклидай зайе бүлэглэхэ дулаанай картын дендрограмма бүтээхэдээ Уордын арга хэрэглэхэ. Бидэ бүхы эсэй түхэл болон микрооршон соо илгарал элбэг метаболитнуудые элирүүлхын тулада стандартизацилагдаһан метаболит элбэг байдал дээрэ лимма (52) хэрэглээбди. Тайлбариие хялбаршуулхын тулада бидэ загбарые тодорхойлхын тулада бүлэгэй дунда зэргын параметр хэрэглэнэбди, тиигээд микрооршон соохи эсэй түхэлнүүдые бүлэг бүхэндэ (n = 6 бүлэгүүд) үзэнэбди; удха шанартай туршалгын түлөө бидэ метаболит бүхэндэ гурба дахин хэмжүүр хэбэбди Хуурамша хубилалтаһаа зайлаха зорилгоор үбшэнтэниие лиммын загбарта һаад болгон оруулһан байна. Ондоо үбшэнтэнэй хоорондохи метаболитнуудай илгаае шалгахын тулада бидэ үбшэнтэниие оруулһан лимма загбарые тогтомол аргаар тааруулһан байнабди. Бидэ Padj <0.05 (Бенджамини-Хохбергын заһабари) эсэй түхэл ба микрооршоной хоорондохи уридшалан тодорхойлогдоһон илгабариин удха шанарые мэдээсэнэбди.
Miltenyi Dead Cell Removal Kit (>80% viability) хэрэглэн эршэ хүсэниие баяжуулһанай һүүлдэ 10x 5′генэй илгаралгын протокол хэрэглэн бүхы амиды хүлдэһэн асцит ба хабдарай дээжэдэ нэгэ эсэй транскриптомой дараалал хэгдэһэн байна. Таарһан хабдартай ба асциттай табан ушар шэнжэлэгдээ, гэбэшье нэгэ хабдарай дээжэһээ амидарал бага байһаниинь тэрэнээ оруулхагүй байгаа. Үбшэнтэниие олон шэлэн абахын тулада бидэ 10x хромой хянадаг зуруудта үбшэнтэн бүхэнэй дээжые нэгэдхэжэ, асцит ба хабдарай газарнуудые тус тустаа шэнжэлээбди. Дараалалгын һүүлдэ [Illumina HiSeq 4000 28×98 bp хос үзүүр (PE), Квебекэй геном; хабдар ба асцит тус тусдаа нэгэ эстэ дунда зэргээр 73,488 ба 41,378 уншалга]], бидэ CellSNP ба Vireo (53) хэрэглээбди (CellSNP дээрэ үндэһэлжэ, GRCh38-аар үгтэһэн ниитэ хүнэй SNP (VCF) донорой шэнжэ тэмдэгтэй. Бидэ SNPRelate хэрэглэн, үбшэнтэнэй генотипэй (IBS) эгээл дүтэ шэнжэ (IBS) тодорхойлнобди асцит ба хабдарай дээжэнүүдэй хоорондохи дуплекс болон тааруулһан донорнууд гэжэ тодорхойлогдоһон эсүүдые болон эсүүдые оруулангүй (54). (2792 ба 4183 эсүүд хабдарһаа ба асцитһаа, тус тусдаа) шэнжэлэлгын тулада Бидэ igraph-ай (57) хубаалсаһан хүршэ сүлжээнэй (SNN) кластеризациие хэрэглэнэбди. эсүүд CD8A ба GZMA-гай илгаралаар тодорхойлогдодог, рибосомын уураг илгарал багатай дэд бүлэгүүдые оруулнагүй.
PBMC-ые лейкоцит илгаруулха бүтээгдэхүүнһээ (STEMCELL Technologies) Ficoll градиент нягта центрифугированиин аргаар тусгаарлаһан байна. CD3 + эсүүдые PBMC-һээ CD3 шүрэнүүдые (Miltenyi) хэрэглэн тусгаарлаһан байна. MNA байгаа гү, али үгы байхада CD3+ эсүүдые хабтагайтай холбоотой CD3 (5μg/ml), уһалдаг CD28 (3μg/ml) ба IL-2 (300 U/ml; Proleukin)-ээр эдэбхижүүлһэн байна. Дэлгэрүүлгын һүүлшын үдэр амидарал (Fixable Viability Dye eFluor450, eBioscience) ба үржэхэ шадабари (123count eBeads, Thermo Fisher Scientific) гүйдэлэй цитометриин аргаар сэгнэгдэһэн байна. PMA (20 нг/мл) ба иономицин (1μg/ml)-ээр GolgiStop-ээр 4 часай туршада эсүүдые эдэбхижүүлжэ, CD8-PerCP (RPA-T8, BioLegend), CD4-AF700 (RPA-T4), BioLegend) ба TNFα-флуоресцетиотианат (TCFIMA1)-ые хинажа, эффекторой үйлэ ажаллалгые сэгнэхэ БД). qPCR ба ChIP эсүүдые PMA (20 нг/мл) ба иономицин (1μg/ml)-ээр 4 часай туршада эдэбхижүүлхэ. ИФА-гай супернатант 4 часай туршада PMA (20 нг/мл) ба иономицин (1 мкг/мл)-ээр эдэбхижүүлхын урда ба һүүлдэ суглуулагдаһан байна.
RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN) хэрэглэн РНК тусгаарлахын тулада үйлэдбэрилэгшын протоколые дагаха хэрэгтэй. Дээжые нэгэдүүлхын тулада QIAshredder (QIAGEN) хэрэглэхэ. Нэмэлтэ ДНХ (кДНХ) синтезлэхын тулада үндэр багтаамжатай РНК-һаа кДНХ-эй комплект (Thermo Fisher Scientific) хэрэглэхэ. TaqMan Rapid Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific) хэрэглэн, генэй илгаралые (үйлэдбэрилэгшын протоколоор) иимэ зондуудаар тодорхойлхо: Hs00196287_m1 (NNMT), Hs00154079_m1 (AOX1), Hs004275551511111,11 Hs02786624_g1 [уһантүрэгшын глицеральдегид-3-фосфат (GAPDH)] ба Hs01010726_m1 (SLC22A2). Дээжые StepOnePlus бодото сагта ПЦР системэдэ (Applied Biosystems) (Applied Biosystems) MicroAmp оптикын пленкэтэй MicroAmp түргэн оптикын 96 худагтай реакциин хабтаһан дээрэ (Applied Biosystems) ашаглаһан байна. Ямаршье Ct сэн 35-һаа дээшэ байбал илгаруулгын босоо хэмжээнһээ дээшэ гэжэ тоосогдодог ба илгаруулагдахагүй гэжэ тэмдэглэгдэнэ.
Урдань тодорхойлһон ёһоор ChIP хэхэ (58). Тобшохоноор хэлэбэл, эсүүдые формальдегидээр (һүүлшын концентраци 1.42%) эмшэлжэ, 10 минутын туршада танхимай температурада инкубаци хэбэ. Нэмэлтэ хабдарай буфер (25 мМ Hepes, 1.5 мМ MgCl2, 10 мМ KCl ба 0.1% NP-40) 10 минутын туршада мүльһэн дээрэ хэрэглэжэ, удаань тайлбарилагдаһан ёһоор иммунопреципитациин буфер соо дахин суспендировагты (58 ). Удаань дээжые иимэ циклнүүдээр ультразвугой шэнжэлһэн байна: 10 цикл (20 1-секундын импульс) ба 40 секундын статик саг. ChIP-сортын иммуноглобулин G (Эсэй дохёо үгэхэ технологи; 1μl), гистон H3 (Эсэй дохёо үгэхэ технологи; 3μl), NFAT (Invitrogen; 3μl) ба SP1 (Эсэй дохёо үгэхэ технологи; 3μl) эсэргүү бодосуудые дээжэтэй 4°CC температурада һүниин туршада хүдэлгэхэ. Уураг А шүрэнүүдые (Thermo Fisher Scientific) дээжэтэй 4°C-та 1 часай туршада зөөлэнөөр хүдэлгэжэ инкубаци хэхэ, удаань ДНХ-ые баяжуулхын тулада chelex шүрэнүүдые (Bio-Rad) хэрэглэхэ, уураг шэнгээхэдээ протеиназа К (Thermo Fisher) хэрэглэхэ. TNFα промоторые ПЦР-ээр элирүүлһэн: урагшаа, GGG TAT CCT TGA TGC TTG TGT; харин эсэргүүгээр, GTG CCA ACA ACT GCC TTT ATA TG (207-bp бүтээгдэхүүн). Зурагуудые Image Lab (Bio-Rad) бүтээжэ, ImageJ программын ашаар тоосоолһон байна.
Эсэй соёлой супернатант дээрэ тодорхойлһон ёһоор суглуулагдаһан байна. Тодорхойлолто хүнэй TNFα ELISA комплект (Invitrogen), хүнэй IL-2 ELISA комплект (Invitrogen) ба хүнэй IFN-γ ELISA комплект (Abcam) үйлэдбэрилэгшын журам ёһоор хэгдэһэн байна. Үйлэдбэрилэгшын протоколоор, супернатант TNFα ба IL-2 элирүүлхын тулада 1:100, IFN-γ элирүүлхын тулада 1:3 шэлжүүлһэн байна. 450 нм-тэ шэнгээхэ шадабариие хэмжэхэдээ EnVision 2104 Multilabel Reader (PerkinElmer) хэрэглэхэ.
PBMC-ые лейкоцит илгаруулха бүтээгдэхүүнһээ (STEMCELL Technologies) Ficoll градиент нягта центрифугированиин аргаар тусгаарлаһан байна. CD3 + эсүүдые PBMC-һээ CD3 шүрэнүүдые (Miltenyi) хэрэглэн тусгаарлаһан байна. МНА-гай байгаа гү, али үгы байхада CD3+ эсүүдые хабтагайтай холбоотой CD3 (5μg/ml), уһалдаг CD28 (3μg/ml) ба IL-2 (300 U/ml; Proleukin)-ээр 3 үдэрэй туршада эдэбхижүүлһэн байна. хоногой үнгэрһэн хойно эсүүдые суглуулжа, 0.9%-тай дабһатай уһаар угаагаад, гранулые түргэн хүлдүүлһэн байна. Эсэй тоо 123count eBeads хэрэглэн гүйдэлэй цитометриин (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R конфигураци) аргаар хэгдэһэн байна.
Дээрэ хэлэгдэһэнэй ёһоор метаболитнуудые гаргажа абагты. Хатаагдаһан экстракт 4000 эсэй эквивалент/мкл концентрацитайгаар һэргээгдэһэн байна. Дээжые урбуу фазын хроматографиин (1290 Infinity II, Agilent Technologies, Santa Clara, CA) ба CORTECS T3 колонкын (2.1×150 мм, хэһэгэй хэмжээ 1.6-μm, нүхэн хэмжээ 120-Å; #186008500, Waters) аргаар шэнжэлхэ. Полярна масс-спектрометр (6470, Agilent), энэнь электрошүршүүрэй ионизаци эерэг горимоор хүдэлдэг. Хүдэлөөнэй А үе 0.1% мэрээшэнэй хүшэлтүрэгшэ (H2O-до), хүдэлөөнэй В үе 90% ацетонитрил, 0.1% мэрээшэнэй хүшэлтүрэгшэ юм. LC градиент 100% А-да 0-һоо 2 минута, 99% В-дэ 2-һоо 7.1 минута, 99% В-дэ 7.1-һээ 8 минута болоно. Удаань 3 минутын туршада 0.6 мл/мин гүйдэлэй хурдаар А хүдэлөөнэй фазатай колонкые дахин тэнсүүлхэ. . Урдалай хурдадхал 0.4мл/мин, баганын танхимые 50°C хүрэтэр халааха. MNA-гай сэбэр химиин стандарт (M320995, Торонто шэнжэлэлгын химиин компани, Хойто Йорк, Онтарио, Канада) хэрэглэн, хадгалха саг (RT) ба хубилалта (RT = 0.882 минута, хубилалта 1 = 137→94.1, хубилалта 2 = 137→92 , Хубилалта = 137→77) тогтоохо. Хэрбээ гурбан шэлжэлтэ зүб хадгалха сагта болоо һаань, 1-дэхи шэлжэлтэ тусхай байдалые хангахын тулада тоосоондо хэрэглэгдэдэг. MNA (Toronto Research Chemical Company)-гай стандарт мурые 0.1, 1.0, 10 ба 100 нг/мл ба 1.0 ба 10 мкг/мл тус тусдаа шэнгэн стандартнуудые абахын тулада эхинэй уһанда (1 мг/мл) зургаан ээлжэлһэн шэлжүүлгээр бии болгоһон байна. Илгаруулха хизаар 1 нг/мл, шугаман харюу 10 нг/мл ба 10 мкг/мл хоорондо. Хоёр микролитр дээжэ ба стандарт тарилга бүхэниие LC/MS шэнжэлэл хэхэдээ хэрэглэдэг ба шэнжэлэлгын платформын тогтвортой байдалые хангахын тулада найман тарилга бүхэндэ холимог шанарай хяналтын дээжые ябуулдаг. Бүхы MNA-ээр эмшэлһэн эсэй дээжэнүүдэй MNA харюунууд шэнжэлэлгын шугаман диапазон дотор байгаа. Мэдээлэлэй шэнжэлэл MassHunter тоогой шэнжэлэлгын программна хангамжа (v9.0, Agilent) хэрэглэн хэгдэһэн байна.
Хоёрдохи үеын αFR-CAR бүтэсэ Song et al.-һаа абтаһан байна. (59). Тобшохоноор хэлэбэл, энэ бүтэсэ иимэ агуулгатай: CD8a ударидагша дараалал, хүнэй αFR-тодорхой нэгэ гинжэтэ хубилдаг фрагмент, CD8a нугалбари ба трансмембранна бүһэ, CD27 эс доторхи домен ба CD3z эс доторхи домен. CAR-эй бүрин дараалалые GenScript-ээр синтезлэжэ, удаань трансдукциин үрэ дүнтэй байдалые сэгнэхэдээ хэрэглэһэн GFP-эй илгаралгын кассетын дээдэ шэглэлэй хоёрдохи үеын лентивирусай илгаралгын векторто клонировалһан байна.
Лентивирус HEK293T эсэй трансфекциин ашаар бии болодог [Америкын түхэлэй соёлой суглуулбари (ATCC); 10% үхэрэй урагай һүн (FBS) ба 1% PenStrep агуулһан Dulbecco-гой хубилгагдаһан Eagle оршондо ургуулһан, CAR-GFP вектор хэрэглэһэн ба бообоной плазмидууд (psPAX2 ба pMD2.G, Addgene) липофекциин амин (Sigma-Aldrich) хэрэглэһэн. Вирус агуулһан супернатант трансфекциин һүүлдэ 48 ба 72 часай үнгэрһэн хойно суглуулагдажа, шүүгдэжэ, ультрацентрифугированиин аргаар концентрировалагдаһан байна. Концентрированна вирусай супернатант -80°C температурада трансдукци болотор хадагалха.
PBMC-ые элүүр донорой лейкоцит тусгаарлаха бүтээгдэхүүнһээ (STEMCELL Technologies) Ficoll градиент нягта центрифугированиин аргаар тусгаарладаг. PBMC-һээ CD8+ эсүүдые тусгаарлахын тулада эерэг шэлэн абалгын CD8 микрошүрэнүүдые (Miltenyi) хэрэглэхэ. Т эсүүдые TransAct (Miltenyi) ба TexMACS оршон [Miltenyi; 3% дулаанаар эдэбхигүй болгоһон хүнэй һүн, 1% PenStrep ба IL-2 (300 U/ml) нэмэгдэһэн]. Эдэбхижүүлгын һүүлдэ 24 часай үнгэрһэн хойно Т эсүүдые лентивирусаар (106 эстэ 10 мкл концентрированна вирусай супернатант) дамжуулһан байна. Cytek Aurora (FSC (Forward Scatter)/SSC (Side Scatter), Singlet, GFP+) дээрэ трансдукциин һүүлдэ 1-һээ 3 хоногой дараа эсэй GFP илгаралые 30%-һаа багагүй трансдукциин үрэ дүнтэй байһые харуулхын тулада сэгнэхэ.
CAR-T эсүүдые 24 часай туршада Immunocult (STEMCELL Technologies; 1% PenStrep-ээр нэмэгдэһэн) иимэ нөхцөлд үрэжүүлһэн байна: эмшэлэгдэдэггүй, 250 мкМ аденозин гү, али 10 мМ MNA-тай эмшэлэгдэдэг. Уридшалан болбосоруулһанай һүүлдэ CAR-T эсүүдые PBS-ээр угаагаад 20,000 SK-OV-3 эсүүдтэй ниилүүлээ [ATCC; McCoy 5A оршондо (Sigma-Aldrich) 10% FBS ба 1% PenStrep 10-да нэмэгдэһэн: 1-эй эффектор ба зорилгын харисаа нэмэгдэһэн Immunocult оршондо гурба дахин үргэдхэгдэһэн байна. SK-OV-3 эсүүд ба SK-OV-3 эсүүдые digitalis saponin (0.5mg/ml; Sigma-Aldrich)-ээр лизис хэһэн тус тусдаа сүлөөтэ ба эерэг хяналтын шэнжэтэйгээр хэрэглэбэ. Хамта таряалангай 24 сагай һүүлдэ супернатантые суглуулжа, үйлэдбэрилэгшын заабариин ёһоор лактатдегидрогеназа (LDH) хэмжэбэ (LDH Glo Cytotoxicity Assay Kit, Promega). LDH супернатантые LDH буфер соо 1:50 шэлжүүлһэн байна. Алалгануудай хубиие иимэ томьёогоор хэмжэжэ үзэбэ: алалгануудай хуби = заһабарилгын хуби / эгээн ехэ алалга х 100%, эндэ заһабарилгын хуби = гансал хамтын үрэжүүлгын Т эсүүд, ба эгээн ехэ алалга = эерэг хяналтын-сөрөг хяналтын хэмжээ.
Текст соо гү, али материалнууд болон аргануудта тодорхойлһон ёһоор, статистикын шэнжэлэл хэхэдээ GraphPad Prism 8, Microsoft Excel гү, али R v3.6.0 хэрэглэхэ. Хэрбээ нэгэ үбшэнтэнһөө (жэшээнь, асцит ба хабдар) олон дээжэ абтабал, бидэ хос t тест хэрэглэнэбди гү, али үбшэнтэниие шугаман гү, али ниитэлһэн загбарта санамсаргүй нүлөө болгон оруулнабди. Метаболомикын шэнжэлэлгын тулада шухала шалгалтые гурба дахин хэнэ.
Энэ үгүүлэлэй нэмэлтэ материалнуудые http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1 харагты
Энэ хадаа Creative Commons Attribution-Non-Commercial License-эй ёһоор тараагдаһан нээлтэтэ нэбтэрхэй толи болоод энэнь ямаршье хэрэгсэлээр хэрэглэхэ, тарааха, хубилгаха боломжо олгодог, хэрбээ һүүлшын хэрэглэлгэ олзын хэрэг эрхилэлгын түлөө бэшэ, анханай бүтээл зүб байха ёһотой. Дурдалга.
Анхарал: Хуудаһанда дурадхаһан хүнтнай энэ сахим бэшэгые харуулхыень хүсэжэ байһанаа, энэнь спам бэшэ гэжэ мэдэхын тулада бидэ гансал өөрынгөө сахим хаягые үгэхыетнай гуйнабди. Бидэ ямаршье сахим хаягуудые абахагүйбди.
Энэ асуудал таанадые айлшан гү гэжэ шалгаха ба автоматаар спам эльгээхэһээ сэргийлхэ хэрэгсэл болоно.
Мариса К. Килгур (Мариса К. Килгур), Сара Макферсон (Сара Макферсон), Лорен Г. Захариас (Лорен Г. Захариас), Абигейл Эли Арис Г. Уотсон (Х. Уотсон), Джон Стагг (Джон Стагг), Брэд Х. Нельсон (Брэд Х. Нельсон), Ральф Дж. Дерард Беллни (Р.Р.Бералди), Дж.Бералди. Джонс (Рассел Г. Джонс), Финеас Т. Гамильтон (Финеас Т.
МНА Т эсэй дархалалай даралгада хубита оруулдаг ба хүнэй хорото хабдар эмшэлхэ боломжотой иммунотерапиин зорилго болоно.
Мариса К. Килгур (Мариса К. Килгур), Сара Макферсон (Сара Макферсон), Лорен Г. Захариас (Лорен Г. Захариас), Абигейл Эли Арис Г. Уотсон (Х. Уотсон), Джон Стагг (Джон Стагг), Брэд Х. Нельсон (Брэд Х. Нельсон), Ральф Дж. Дерард Беллни (Р.Р.Бералди), Дж.Бералди. Джонс (Рассел Г. Джонс), Финеас Т. Гамильтон (Финеас Т.
МНА Т эсэй дархалалай даралгада хубита оруулдаг ба хүнэй хорото хабдар эмшэлхэ боломжотой иммунотерапиин зорилго болоно.
©2021 Эрдэм ухаанай хүгжэлэй Америкын холбоо. бүхы эрхэнүүд хамгаалагдаһан. AAAS хадаа HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef болон COUNTER-эй түншэ юм. Эрдэм ухаанай дэбжэлтэ ISSN 2375-2548.