Nature.com сайт руу ороһондотнай баяртай байнабди. Танай хэрэглэжэ байһан браузерай хубилалта CSS-ые хизгаарлагдамал дэмжэлгэтэй. Эгээл һайн дүршэлтэй болохын тула шэнэлэгдэһэн браузер хэрэглэхэеэ дурадханабди (гү, али Internet Explorer-да таарамжатай горимые унтарааха). Гэхэ зуура, үргэлжэлһэн дэмжэлгые хангахын тулада бидэ сайтые маяг болон JavaScriptгүйгөөр харуулхабди.
Нюрганай амитадһаа илгаатайгаар хорхой шумуулнууд эрэ хүнэй бэлгын стероид гормонуудгүй гэжэ үргэнөөр үзэдэг. Anopheles gambiae-да экдизон стероид 20-гидроксиэкдизон (20E) эмэ амитадай синтез хэхэдээ үндэгэнэй хүгжэлые хянаха2 ба эрэ үндэгэнэй бэлгын хүгжэлэй хугасаагаар дамжуулагдаха үедэ ниилэлтын үрэ дүн үүсхэхэ зорилготойгоор бии болоһон мэтээр харагдана. ба ниилэлгэ хадаа үрэжүүлгын шухала шэнжэнүүд болоно, эмэ Anopheles шумуулнууд эдэ гормональ дохионуудые яажа нэгэдүүлдэгые ойлгоходо хумхаа үбшэнтэй тэмсэхэ шэнэ программануудые зохёон бүтээхэ хэрэгтэ туһалха аргатай. Эндэ эдэ үрэжүүлгын үйлэ ажалалгаануудые экдистероид эдэбхижүүлдэг/эдэбхигүйжүүлдэг ферментүүдэй комплексно сүлжээгээр дамжуулан илгаатай бэлгын стероидууд зохисуулдаг гэжэ элирүүлнэбди. 3-дегидро-20E (3D20E), энэнь бэлгын дамжуулгын һүүлдэ эмэгтэй хүнэй бэлгын хүлеэн абаха шадабариие хаажа, дефосфорилированиин аргаар эдэбхижүүлжэ эхэ эсэгые хамгаалдаг. Онсолон тэмдэглэхэдэ, 3D20E дамжуулга Plasmodium халдабариин үедэ үндэгэнэй хүгжэлые хадгалдаг үржэхэ генүүдэй илгаралые үүсхэжэ, халдабарита эмэгтэй эмэгтэйн элүүрые хангадаг. бэлгын харюу, харин 20E-даралгын киназануудые дараха һүүлдэ ниилэжэ байһан хүнүүдтэ үндэгэ табиха боломжо олгодог. Энэ эрэ хүнэй тусхай хорхой шумуулнуудай стероид гормоной элирүүлгэ ба эмэ хүнэй бэлгын хүлеэн абаха шадабари, үрэжүүлгэ ба Plasmodium-тай харилсан үйлэшэлэлгэ зохисуулха үүргэ хумхаа үбшэн дамжуулдаг шумуулнуудай үржэхэ амжалта багадхаха боломжотой гэжэ тэмдэглэнэ.
Хумхаа үбшэнэй ушарнууд болон үхэлнүүд дахин нэмэгдэжэ байна4, юундэб гэхэдэ хүнэй хумхаа үбшэнэй паразитнуудай ганса дамжуулагша болохо Anopheles шумуулнуудай хорхой шумуул усадхаха эсэргүүсэл үргэн тархаһанһаа болоно. Эдэ шумуулнуудай ниилэлгын биологинь хумхаа үбшэнтэй тэмсэхэ шэнэ арга хэмжээнүүдтэ илангаяа татамаар зорилго болоно, юундэб гэхэдэ эмэ шумуулнууд гансал нэгэ удаа ниилэнэ5; энэ нэгэ ниилэлгын үйлэ ябасые үрэгүй болгоходо, талмай дээрэ шумуулнуудай тоо үсөөрүүлхэ ехэ арга боломжотой.
Эхэнэрнүүд эрэгтэйшүүлһээ үндэр титртэй стероид гормон абаһанай удаа бэлгын харилсаанда орохо аргагүй болодог. Шэнжэлэлгын дүнгөөр ​​саашадаа ниилэхэ бэрхэшээлэй шалтагаан 20-гидроксиэкдизон (20E) болоно, энэнь стероид гормон болоод энэнь авгалдай шатада һэлхэ циклэй зохисуулагша гэжэ мэдээжэ юм. Африкада тархаһан, хумхаа үбшэнэй эгээл аюултай векторнуудые, тэрэ тоодо Anopheles gambiae-ые багтааһан Cellia7 дэд түрэлэй нэгэ хубинь. Энэнь илангаяа тэмдэглэмээр, юундэб гэхэдэ эдэ зүйлнүүдтэ эмэ амитад шуһанай хоол бүхэнэй һүүлдэ 20E гаргадаг, 20E оогенезэй циклые хүтэлбэрилдэг (8-дахи тэмдэглэлые харагты). Гэбэшье, эмэ амитадай хоёр эхи үүсэбэриин ондо ондоо дохинуудые ямар аргаар холбодог тухай бага мэдээжэ. экдизон (эрэ дамжуулга ба шуһаар хооллолго) өөрынгөө ниилэхэ шадабариие алдагдуулхагүйгөөр. Үнэндөө, эмэ шумуулнуудай үйлэдбэрилһэн 20E бэлгын тэсэбэригүй байдалые үүсхэбэл, энэнь эдэ шумуулнуудта тон түгээмэл абари зан болохо онгон хооллодог хүнүүдтэ үрэгүйдэлдэ хүргэхэ5.
Боломжотой тайлбаринь гэхэдэ, A. gambiae эрэ амитад эрэ амитанай тусхай экдизон дамжуулдаг, энэнь эмэ амитанай үрэ хүүгэдэй замда дохёо дамжуулха каскадые эдэбхижүүлжэ, ниилэлтын тогтворгүй байдалые үүсхэнэ. Гэбэшье, нюрганай амитад эстроген ба андроген (9-дэхи тэмдэглэлдэ шэнжэлэгдэһэн) гэхэ мэтэ олон стероид гормонуудтайшье һаа, манай мэдэһээр, стебиоген ба стероид гормонууд элирүүлэгдээгүй байна хорхой шумуулнуудта.
Бидэ бэлгын болбосорһон A. gambiae-гай эрэ хүнэй нэмэлтэ булшархайн (MAG) стероид гормонуудай репертуарые тодорхойлхоёо оролдобобди, энэнь өөршэлэгдэхэ стероидуудые бэдэржэ байгаа. Урдань хэрэглэгдэһэн бага тусхай аргаар бэшэ, харин тандем масс-спектрометритэй (HPLC-MS/MS) үндэр гүйсэдхэлтэй шэнгэн хроматографи хэрэглэн, бидэ энэ edy (E2020) соо илгаруулбабди эд, урданай дүнгүүдые баталан харуулна. Гэбэшье, дээжэ соо 3-дегидро-20Е-22-фосфат (3D20E22P)12 (Зураг 1) гэһэн томьёотой тааруу исэлдэһэн фосфорилированна стероидууд давамгайлһан байна. Бусад түхэлнүүдтэ 3-дегидро-20Е (3D20E22P) ба 20-E22-фосфат ороно (20E22P). 3D20E22P-эй HPLC-MS/MS дохёоной эршэм хүсэн тэрэнэй дефосфорилированна түхэл 3D20E-һээ хоёр дахин ехэ, E ба 20E-һээ гурбан дахин ехэ байгаа (Зураг 1). Хэдыгээр бэеын бусад хэһэгүүдтэ ба үрэжүүлгын доодо хэһэгтэ (Зураг 1) мүн шэнэ хаагдаһан (<1 үдэртэй) эрэ эмэ амитадай экдистероидуудые шэнжэлжэ, гансал MAG-да 3D20E ба 3D20E22P элирүүлһэн; E, 20E ба 20E22P хоёр хүйһэндэ байгаа (Үргэдхэгдэһэн мэдээсэл Зур. 1b). Эдэ мэдээнүүд A. gambiae томо эрэгтэйшүүл эмэгтэйшүүлэй синтезировалдаггүй MAG-нуудтаа үндэр титр хубилха гормонуудые үйлэдбэрилдэг гэжэ тэмдэглэнэ.
MAG ба эмэ LRT (энэ тоодо тосхон, үрэһэтэй везикулнууд, ба паровариум) 4 хоногой (4 хоногой) онгон эрэгтэй ба онгон ба ниилэһэн эмэһээ (0.5, 3, ба 12 hpm) дискретизацилагдаһан байна. Эдэ эдүүдэй экдизон HPLC-MS/MS-ээр шэнжэлэгдэһэн (хоёр талагүй хахад талнууд, ± t-pad; худал нээлтын хэмжээн (FDR) заһабарилагдаһан; NS, удха шанаргүй; *P < 0.05 .3D20E: 3 час vs. 0.5 час, P = 0.035; 12 час vs. 3 час, P = 0.0015; 12 час vs. 3D20E22P: 3 час vs. 0.5 час, P = 0.25; 12 час vs. 3 час, P = 0.0032; 12 час vs. 0.5 час, P = 0.015). шумуулнууд.Экдизон иимэ үнгөөр ​​харуулагдана: Е, ногоон; 20E, улбар шар; 20E22P, ягаан; 3D20E, хүхэ; 3D20E22P, ягаан. Оруулга y-тэнхэлэг дээрэхи хэмжүүрые нэмэгдүүлжэ, экдизоной доодо хэмжээе харуулна.
3D20E22P ба 3D20E ниилэлгын үедэ дамжуулагдадаг гү гэжэ шэнжэлхын тулада бидэ ниилэлгын һүүлдэ элдэб сагта эмэ LRT-нүүдые шэнжэлээбди. Хэдыгээр экдизон онгон эхэнэрнүүдтэ олдоогүйшье һаа, бидэ ниилэлгын һүүлдэ LRT-дэ 3D20E22P-эй нилээд ехэ хэмжээе ажаглаһан байнабди (05 h-һүүлдэ, удаан хугасаанай туршада бууража байгаа). 3D20E хэмжээн ехээр нэмэгдэбэ (Зураг 1). Химиин аргаар синтезлэгдэһэн 3D20E-ые стандарт болгон хэрэглэжэ, бидэ энэ стероид гормоной хэмжээн ниилэхэ LRT-нүүдтэ 20E-һээ 100 дахин ехэ байгаа гэжэ тодорхойлбобди (Үргэдхэгдэһэн мэдээсэлэй таблица 1). Тиимэһээ 3D20E22P эрэ эмэ LRT-эй үедэ эмэ LRT-дэ дамжуулагдадаг гол эрэ амитан болоно ниилэхэ, тэрэнэй дефосфорилированна хэлбэри, 3D20E, ниилэхэһээ хойшо удангүй ехэ элбэг болодог. Энэнь һүүлшын экдизоной эмэ ниилэхэ һүүлшын биологидо шухала үүргэтэй гэжэ тэмдэглэнэ.
Шэнэ РНК-секвенированиин (RNA-seq) мэдээсэлэй багтаамжа (Зур. 2а) бии болгоһоной удаа, захиалгаар бүтээгдэһэн биоинформатикын дамжуулгын шугамые хэрэглэн, бидэ экдизон киназа (EcK), экдизон оксидаза (EO), ба 20E-хубилгагдаһан фосфатаза кодлодог экдизон генүүдые үрэжүүлгын эд эстэ илгаруулдаг гэжэ бэдэрээбди. нэгэ кандидат EPP ген ба хоёр боломжотой EcK ген (EcK1 ба EcK2) элирүүлһэн, зүгөөр һайн кандидат EO ген оложо шадаагүй. Онсолон тэмдэглэхэдэ, ганса EPP генүүд Гамбиин MAG-уудта үндэр хэмжээндэ (98.9-дэхи процентиль) илгаруулагдаһан, харин эмэгтэй LRT-нүүдтэ илгаруулагдаагүй (Зураг 2b), манай хүлеэһэнэй эсэргүүгээр 2022 EcK1-эй фофороляци болоһонһоо хойшо энэ эмэ эд эстэ. Тиимэһээ бидэ эрэ EPP ниилэхэ үедэ дамжуулагдажа болохо гэжэ этигэнэбди. Үнэхөөрөөшье, бидэ ниилэлгын һүүлдэ эмэ уурагые нюухын тулада in vivo тогтвортой изотоп тэмдэглэлгэ хэрэглэбэбди, эмэ тосхоной MS-ээр тодорхойлогдоһон фермент (Зураг 2в ба нэмэлтэ таблица 1). тусхай эсэргүү бодосуудые хэрэглэжэ (Зур. 2d).
a, EcKs, EOs, EPPs кодлодог генүүдые эрэ эмэ бүхэнэй үржэхэ эдһээ бэдэрхэ захиалгаар бүтээгдэһэн биоинформатикын шугам. Сумуудай хажуудахи тоонууд алхам бүхэндэ эрэ, эмэ кандидатнуудай тоо харуулна. Энэ шэнжэлэлгын дүнгөөр ​​нэгэ EPP ген (EPP) ба нэгэ EcK ген (EcK1) генүүдтэ илгаруулагдана, эдэнь EcKs, EOs ба EPP генүүдтэ илгаруулагдана (EcK2) хоёр хүйһэндэ илгаруулагдадаг болобошье EO генэй кандидат үгэдэггүй.b, онгон (V) ба ниилэлтэ (M) Anopheles gambiae ба Anopheles albicans эдэй кандидат генэй илгаралые зэргэсүүлһэн дулаанай карта.Spca, үрэжүүлгэ; MAGs, эрэгтэйшүүлэй нэмэлтэ булшархайнууд; бэеын бусад хэһэгүүд, тэрэ тоодо һүүл, жэгүүр, хүл, өөхэн бэе, эрэ эмэ хоёрой дотоодо эрхэтэнүүд, эмэгтэйшүүлэй умайн хүзүү.EcK2 Гамбиин MAG болон тосхон хоёрто ехээр илгаруулагдадаг, харин EPP гансал MAG.c-дэ байдаг. эгээл элбэг 67 уурагууд. Эмэ амитадые бүхы уурагуудые тэмдэглэхэ (ба нюуха) зорилгоор 15N агуулһан хоол хүнэһэн дээрэ үргэжэ абаһан. Тэмдэглэгдээгүй эрэ амитадые тэмдэглэгдэһэн эмэ амитадтай ниилүүлһэн, эмэ амитадай LRT-нуудые 3, 12 ба 24 hpm-да протеомой шэнжэлэл хэхэдээ һалгаһан (Ejaculatory уурагуудай дүүрэн жагсаалтые нэмэлтэ таблица 1 харагты, EPP, Inset). Eck1 ба EcK2 эдэ эдэй протеомическа шэнжэлэлгээр онгон эрэгтэйшүүлэй MAG-да элирүүлэгдэһэн байна.d, EPP ниилэһэн эмэгтэйшүүлэй MAG ба LRT-дэ вестерн-блот аргаар элирүүлэгдэһэн, харин онгон эмэгтэйшүүлдэ гү, али эрэгтэйшүүлдэ гү, али эмэгтэйшүүлэй бусад бэеын бусад хэһэгтэ элирүүлэгдээгүй. Мембрануудые анти-реактив (EPP) ашагладаг эсэргүү бодосуудаар нэгэ доро шэнжэлһэн ба эрэгтэйшүүл анти-АПП болоно. онгон.Гель эхинэй мэдээсэлые нэмэлтэ зураг 1 харагты.Вестерн-блот хоёр дахин адли дүнгүүдтэйгээр хэгдэһэн байна.
EPP-эй экдистероид фосфосфатазын эдэбхитэй байдалые MAG-һээ тусгаарлагдаһан 3D20E22P-тэй HPLC-MS/MS-ээр инкубаци хэһэнэй удаа шалгаһан байна (Үргэдхэгдэһэн мэдээсэл Зур. 2а). Үшөө тиихэдэ, бидэ EPP-ые РНК-зууршалһан нүлөөлэлэй (RNAi) аргаар абяагүй болгоходоо, эдэ тисуфазануудай үрэжүүлгын фосфатазын эдэбхитэй байдалые ехээр бууруулжа байһые элирүүлээбди эрэгтэйшүүл (Зураг 3а), ба EPP-абяагүй болгоһон эрэгтэйшүүлтэй ниилэһэн эмэгтэйшүүл генэй хэһэг хубиин абяагүй болоһоншье һаа, дефосфорилированна 3D20E-эй (Зураг 3б) бага хубиие харуулһан байна (Үргэдхэгдэһэн мэдээсэл Зур. 2б,в). 3D20E22P-дэ тусхай (Зураг 3б).
a, Хоёр һүлжээтэй EPP РНК (dsEPP) гү, али хоёр һүлжээтэй GFP РНК (dsGFP) хяналтые хэрэглэн EPP-эй абяагүй болгохоһоо боложо MAG-да фосфатазын эдэбхитэй байдал буурһан байна. Дабталга бүхэндэ 20 MAG пул хэрэглэгдээ (P = 0.0046, хос t-шалгалта, хоёр талаһаа, Feb-тэй тусгаарлагдаһан домануудаар харуулагдана. EPP-абяагүй болгоһон эрэгтэйшүүл 3 hpm-дэ дефосфорилированна 3D20E-эй хубиие мэдэгдэхүйсэ багатай байгаа (P = 0.0043, хосгүй t-тест, хоёр талаһаа), харин 20E-эй хэмжээн нүлөөгүй (P = 0.063, хосгүй). t-шалгалта, хоёр талаһаа). Мэдээллые 13, 16 ба 19 эмэ гурбан бүлэгһөө дунда зэргээр ± sem гэжэ харуулаа.c, EPP-абяагүй болгоһон эрэгтэйтэй ниилэһэн эмэгтэйшүүл дахин ниилэхэ үндэр хэмжээтэй байгаа (P = 0.0002, Фишерэй нарин туршалга, хоёр талатай).Эмэ амитад ниилэхэ статусаа баталхын тулада анха түрүүн ниилэхэ баатай болоо; 2 хоногой һүүлдэ тэдэниие трансген үрэ абажа ябаһан бусад эрэгтэйшүүлтэй холбоо баряад, трансгенэй тоогой ПЦР-ээр илгаруулха замаар дахин ниилэхэ хэмжээе сэгнэбэ.d, EPP-абяагүй болгоһон эрэгтэйшүүлтэй ниилэһэн шуһаар хооллоһон эмэгтэйшүүлэй үрэ хүүгэдэй үрэ дүн ехээр буурһан (P < 0.0001; Mann-Whitney test, хоёр талаһаа бага зэргэ буурһан (P < 0.0001; Mann-Whitney test, хоёр талаһаа) ба бага зэргэ буурһан үндэгэнэй тоо (P = 80,000, = 8.000). Манн-Уитниин туршалга, хоёр талаһаа) , харин үрэжүүлгын хурдадхал нүлөөлөөгүй (P = 0.94, Фишерэй нарин туршалга, хоёр талаһаа). Бүхы панелнүүдтэ n биологическа бэеэ дааһан шумуулнуудай дээжэнүүдэй тоое харуулна.NS, удха шанаргүй.*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.01, *** P < 0.01 < P < 0.00 *0.
Удаань, бидэ экдизоной дефосфорилировани эмэгтэйшүүлэй ниилэлгын эсэргүүсэлые үүсхэхэ шухала гү гэжэ сэгнэбэбди. Онсолон тэмдэглэхэдэ, EPP-гүй эрэгтэйшүүлтэй ниилэһэн эмэгтэйшүүл нэмэлтэ (трансген) эрэгтэйшүүлтэй харилсахадаа хяналтын эмэгтэйшүүлһээ (10.4%) хамаагүй үндэр дабтамжаар (44.9%) дахин ниилүүлдэг (Зураг 3-дахи Wc мүн лэ мэдэгдэхүйсэ буурһан байна). үрэжэл (Зураг 3d, зүүн) ба эдэ эмэ амитадай үндэгэнэй тоо бага зэргэ буурһан (Зураг 3d, дунда), харин эмэ амитадай үндэгэнэй хуби (эмэ амитадта ниилэхэ замаар үүсхэгдэһэн үшөө нэгэ харюу)) нүлөөлөөгүй (Зураг 3d, баруун). Эдэ дүнгүүдэй EPP20202-ой ажаглагдаһан онсогой байдалые хаража үзэхэдэ ниилэлтын үедэ дамжуулагдаһан EPP-ээр 3D20E-эй эдэбхижүүлгэ эмэгтэй хүнэй саашадаа ниилэлтын хүлеэн абаха шадабариие унтарааха шухала үүргэтэй байжа болоно, энэнь урид 20E-эй бэлгын дамжуулгада хамаарагдаһан абари зан юм. Тиимэһээ энэ эрэ хүнэй тусхай гормон эмэгтэй хүнэй үрэжүүлгэдэ баһал ехээр нүлөөлдэг.
Удаань, бидэ 20E ба 3D20E-эй үйлэ ажаллалгые химиин аргаар синтезлэгдэһэн 3D20E (Зураг 4а–в) ба худалдаанда байдаг 20E хэрэглэн, бэлгын болбосорһон онгон эхэнэрнүүдэй тарилгын туршалгануудта зэргэсүүлээбди. 4d).Олон тэмдэглэхэдэ, LRT-дэхи 3D20E-эй физиологическа хэмжээнэй хахад (1,066 pg тарилгын һүүлдэ vs. 2,022 pg ниилэлгын һүүлдэ) 20E-эй физиологическа хэмжээнһээ 20 дахин ехэ галта эмэ амитадай хубиие үүсхэһэн (361 pg тарилгын һүүлдэ) эгээл ехэ концентрацитай 24 часай һүүлдэ 18 хуудаһан ниилэлгын һүүлдэ; Үргэдхэгдэһэн мэдээсэлэй таблица 1).Энэ дүнгүүд 20E-гэй бэлгын дамжуулга ниилэлгын галта үеые үүсхэнэгүй гэһэн ойлголтотой тааруу, тиигээд 3D20E-ые эхэ эсэгэ-үхибүүнэй харилсаае хангаха гол хүшэлтүрэгшэ гэжэ харуулна. 3D20E мүн онгон эмэгтэйшүүлэй үндэгэ табиха шэнжэлэлнүүдтэ 20E-һээ мэдэгдэхээр эдэбхитэй байгаа (Зураг 4), энэнь үндэгэлхэ хурдадхал хэб маягтай гэжэ тэмдэглэнэ. EPP-эй хэһэг хубиин абяагүй болгоһоной һүүлдэ ажаглагдаһаниинь Mating-induced эмэ хүшэлтүрэгшэдэй үшөөл үйлэдбэрилһэн үлэгдэл 3D20E эдэбхитэй байһанһаа болоһон юм.
(a,b) 20E-һээ химиин аргаар синтезлэгдэһэн 3D20E (a) тон ехэ хубилалта/үрэ дүнтэй (гурбан бэеэ дааһан синтезэй урбалнуудһаа дунда зэргын ± sem-ээр үгтэһэн мэдээсэл) (b).c, Масс-спектр (доодо хахад) ниилэһэн эмэ LRT-дэ олоһон экдизонтой тон таарана (дээдэ хахад, 2006-тай харисуулхада). µg, P = 0.02; 0.21 µg, P < 0.0001; Фишерэй нарин туршалга, хоёр талаһаа) ба 10% этанол (0.63 µg, P < 0.0001; 0.21 µg, P < 0.0001; 0.0001; Fisher's 0.0001; гансал ехэ тунгаар (0.63 мкг, P = 0.0002; 0.21 мкг, P = 0.54; Фишерэй нарин туршалга, 2-талтай) хяналтынхиһаа үлүү.e, 3D20E тарилга 10% этанол хяналтын (P = 0.00 μg, P = 0.54) онгон эмэ амитадта үрэжүүлгын үндэр хэмжээе үүсхэбэ. 0.0001; 0.13 мкг, P = 0.0003; Фишерэй нарин туршалга, хоёр талаһаа), харин 20E хяналтын бүлэгтэй харисуулхада Гансал ехэ тунгаар (0.21 мкг, P = 0.022; 0.13 мкг, P = 0.0823 Fisher's нарин туршалга; үндэр тунгаар 20E-һээ мэдэгдэхүйсэ үндэр үрэжүүлгын хурдадхал (0.21 мкг, P = 0.0019; 0.13 мкг, P = 0.075; Фишерэй нарин туршалга, хоёр талаһаа). Бүхы панелнүүдтэ n биологическа бэеэ дааһан шумуулнуудай дээжэнүүдэй тоое харуулна. ***P < 0.001, ****P < 0.001. Мэдээлэлнүүд гурбан дабталгаһаа абтаһан байна.
Урдахи шэнжэлэлнүүдтэ бидэ стероид гормонуудай бэлгын дамжуулга MISO (Mating-Induced Stimulator of Oogenesis 11)-эй илгаралые үүсхэнэ гэжэ тодорхойлһон байнабди, энэнь A. gambiae эмэ амитадые P. falciparum халдабариһаа хамгаалдаг эмэ үрэжүүлгын ген юм. хумхаа үбшэнэй эндемик газарнуудта бидэ 3D20E гү, али 20E ямар гормон энэ генэй илгаралые үүсхэнэб гэжэ тодорхойлхо гэжэ шиидэбэбди. 20E тарилга тусхайтаар гү, али үлүү хүсэтэйгээр зарим ядрогой гормоной рецепторнуудые (HR), жэшээнь HR3 ба HR4, ба еһотой доодо шэглэлэй стероид зорилгонуудые, жэшээнь, V114, V11, MISO үлүү хүсэтэй байгаа гэжэ элирүүлээбди. 3D20E-ээр үүсхэгдэһэн (Үргэдхэгдэһэн мэдээсэлэй зураг 3). Тиимэһээ энэ андрогеннэ стероид гормоной бэлгын дамжуулга эмэгтэйшүүлые паразит халдабариһаа үүдэһэн гаргашаһаа хамгаалха механизмуудые үүсхэнэ. Үшөө тиихэдэ 3D20E EcR рецепторой EcR-эй хоер изоформодо илгаатай нүлөө үзүүлдэг, EcR ба EcR-B-ые багадхадаг ба EcR-A-ые үлүү ехээр бууруулдаг эмэгтэй хүнэй үрэ хүүгэдтэй болоходо нүлөөлдэг HPX15 гэхэ мэтэ бусад ниилэлгэ үүсхэгшэ генүүдые шангаар үүсхэнэ. Энэнь EPP-абяагүй болгоһон эрэгтэйшүүлтэй ниилэһэн эмэгтэйшүүлдэ ажаглагдаһан үндэр үрэгүйдэлые тайлбарилжа магадгүй (Үргэдхэгдэһэн мэдээсэл Зураг 3). Эдэ мэдээнүүд бэлгын тусхай үйлэ ажалалгаа доро байжа болохо хоёр экдисон гормонуудаар илгаран эдэбхижүүлһэн доодо замууд бии гэжэ тэмдэглэнэ.
Удаань, бидэ манай биоинформатикын дамжуулгада элирүүлһэн хоёр EcK генэй үйлэ ажаллалгые туршабабди. EcK1 гү, али EcK2-ые дуугүй болгоходо эрэгтэйшүүлэй үхэл ехэдхэһэн байна (Үргэдхэгдэһэн мэдээсэл Зур. 4а), энэнь экдизоной фосфорилировани, тиимэһээ эдэбхигүй бололго амидаралда шухала гэжэ тэмдэглэнэ. Юундэб гэхэдэ EcK2-эй хэмжээн EcK1-һээ үндэр хэмжээндэ илгаруулагдаһан байгаа протеомикын аргаар MAG-уудта элирүүлэгдэһэн (Зураг 2b,c ба Нэмэлтэ таблица 2), бидэ 20E-тэй инкубаци хэжэ экдистероид киназа эдэбхитэй байдалые баталһан, энэнь 20E22P-эй фосфорилированиие үүсхэһэн (Үргэдхэгдэһэн мэдээсэлэй Зураг 2).4b).3D20E-ые субстрат болгон хэрэглэхэдээ, бидэ фотографиин бүтээгдэхүүн элирүүлэгдэхэгүй 3D20E22P (Үргэдхэгдэһэн мэдээсэл Зур. 4c), энэнь 3D20E бэшэ, харин 20E EcK2-эй илгаатай зорилго байжа болохо гэжэ тэмдэглэнэ.
Манай RNA-seq шэнжэлэлгын ёһоор, EcK2 мүн лэ онгон эмэ амитадай LRT-дэ ехээр илгаруулагдаһан байгаа, тэндэ энэнь ниилэһэнэй һүүлдэ унтараагдаһан байгаа (Зураг 2б). Бидэ эдэ мэдээнүүдые баталжа, EcK2 илгарал шуһаар хооллолгодо нүлөөлдэггүй гэжэ тодорхойлһон байнабди (Зураг 5а). Анханай MS туршалгануудые үргэдхэжэ, бидэ 2022-дохи EcK2-эй орьёлые тодорхойлһон байнабди 20E-эй орьёлтой холбоотой (шуһанай эдеэнэй һүүлдэ 22-26 час; үргэдхэгдэһэн мэдээсэл Зур. 5b). Онгон эхэнэрнүүдэй EcK2-ые дуугүй болгоходо шуһанай эдеэнэй һүүлдэ 26 сагта 20E-һээ 20E22P-эй харисангы харисаа 3 дахин нэмэгдэһэн байна (Ургатаһан мэдээсэлэй зурагууд 2c ба 5b), энэнь EcK2-ые баһа батална 20E эмэгтэйшүүлдэ. Онсолон тэмдэглэхэдэ, EcK2-гүй онгон эхэнэрнүүд бэлгын харилсаанда дүүрэн хүлеэн абаха шадабаритай байгаа (Үргэдхэгдэһэн мэдээсэл Зур. 5d,e), энэнь эмэгтэйшүүлэй 20E үйлэдбэрилэл ниилэлтын тэсэбэритэй үеые үүсхэнэгүй гэжэ тэмдэглэнэ. Гэбэшье, эдэ эмэгтэйшүүл 30%-һаа дээшэ үндэгэлһэн онгонтой харисуулхада үндэгэлхэ хэмжээе мэдэгдэхүйсэ нэмэгдүүлһэн байна (Үргэдхэгдэһэн мэдээсэл Зур. 5f). Хэрбээ шуһа тэжээһэнэй һүүлдэ хоёр һүлжээтэй Eck2 РНК (dsEcK2) тарилга хэгдэһэн байгаа һаань, үрэжүүлгэ болоогүй, энэ үедэ шуһа ууһанһаа боложо 20E орьёл буурһан байгаа. Юрэнхыдөө, эдэ дүнгүүд шуһа һуулгаһанай һүүлдэ бии болоһон 20E үрэжүүлгэ үүсхэхэ аргатай гэһэн загбарые баталан харуулна, харин гансал үрэжүүлгэ (EK2 магадгүй бусад хүшэлтүрэгшэд) ниилэлтээр унтараагдадаг. 20E болон 3D20E тарилганууд онгон эхэнэрнүүдэй EcK2 илгаралые дарахагүй (Үргэдхэгдэһэн мэдээсэл Зураг 5g), энэнь бусад хүшэлтүрэгшэд энэ киназа даралга зууршалдаг гэжэ тэмдэглэнэ. Гэбэшье, шуһаар хооллоһоной һүүлдэ 20E хэмжээн таагүй байдалые үүсхэхэ хангалтатай бэшэ, харин үрэ дүнтэйгээр үүсхэдэг бэлгын замаар дамжуулһан 3D20E.
Манай дүнгүүд A. gambiae-гай үрэжүүлгын амжалта зохисуулдаг механизмууд тухай шухала ойлгосо үгэнэ. Эрэ амитад 3D20E-эй үндэр титрнүүдые синтезлэхэ загбар бии болоһон байна, энэнь эрэ хүнэй тусхай хубилгагдаһан экдизон болоод эмэ амитадые саашадаа ниилэхэ мэдрэмжэгүй болгожо эхэ эсэгые баталдаг. Энэл үедэ эдэ векторнууд хумхаа үбшэнүүдэй үрэ дүнтэй системые хүгжөөһэн байна. эрэ хүнэй EPP-эй бэлгын дамжуулгада харюусахын тулада эмэ амитадта 3D20E эдэбхижүүлнэ. Манай мэдэһээр, энэ хадаа эрэ хүнэй ба эмэ хүнэй давамгайлһан стероид гормоной системын хорхой шумуулнуудта онсогой ба шухала үүргэ дүүргэдэг түрүүшын жэшээ болоно. Эрэ хүнэй тусхай экдизоной үүргэ тухай хэлэгдэһэн болобошье тодорхойгоор харуулагдаагүй. 20E уридшалан үүсхэгшэ E1-ээр гүйсэдхэгдэжэ болохо. Drosophila-да монандри үүсхэдэг гэжэ мэдээжэ, эмэгтэй хүнэй үрэжүүлгын замые тусхай бэлгын пептидэй рецепторнуудаар дамжуулан мэдрэлжүүлдэг нейронуудтай харилсан үйлэшэлдэг бага бэлгын пептидүүдэй бэлгын дамжуулгаһаа үүдэлтэй19,20. A20D гамбида ударидадаг доодо шэглэлэй дохёо дамжуулха каскадые тодорхойлхын тулада саашадаа ажал хэхэ хэрэгтэй. эмэ амитад болон эдэ каскадуудые шумуулнууд болон дрозофила хоорондо хадгалжа болохо гү гэжэ тодорхойлхо.
Манай шэнжэлэлгын дүнгөөр ​​3D20E-эй эмэгтэй хүнэй үрэжүүлгэ ба абари зан дээрэ шухала үүргэтэй байһые хаража үзэхэдэ, 3D20E-эй синтез ба эдэбхижүүлгэдэ хүргэдэг замууд ерээдүйн шумуулые усадхаха стратегинуудта шэнэ арга боломжонуудые үгэнэ, жэшээнь, ариун хорхой шумуулнуудай технологиин стратегинуудта үрэ дүнтэй ариутгаһан эрэ амитадые бии болгохо. 3D20E нь A. gambiae болон бусад Cellia зүйлнүүдэй үрэһэеэ ниилэхэ залгуурта нягталха шадабаритай болоһон үедэ бии болоһон байжа магадгүй, юундэб гэхэдэ энэнь олон тооной гормон болон гормон эдэбхижүүлдэг ферментүүдые үрэ дүнтэй дамжуулха боломжо олгодог. хумхаа үбшэнэй тархалта ехэтэй газарнуудта, энэнь Plasmodium дамжуулгада шууд бэшэ хубита оруулдаг. Эмэ 20E эмэ Anopheles шумуулнуудта P. falciparum-ай амидарал ба ургалтада гүнзэгы нүлөө үзүүлдэг гэжэ үзүүлһэн тула,24 эрэ ба эмэ стероид гормоной замууд мүнөө шумуул-паразит хоорондын харилсаанай гол талнууд болоно.
A. gambiae G3 омогуудые хорхой шумуулнуудай стандарт нөхцөлд (26-28 °C, 65-80% харисангы чийгшэл, 12:12 саг гэрэл/хара фотопериод) үрэжүүлһэн байна. Авгалдай загаһанай нунтаг эдеэгээр (TetraMin Tropical Flakes, Koi Pellets and Tetra Pond Sticks 7:7:2) харисаагаар тэжээгдэһэн байна. шумуулнуудые 10% декстрозын уһанда ба долоон хоногой хүнэй шуһаар (шэнжэлэлгын шуһанай бүридүүлэгшэ) дуратайгаар хооллодог байгаа. Онгон шумуулнуудые микроскопоор үзүүрыень шалгаһанай удаа хүүгэдэй шатада хүйһыень илгажа абаһан байна. DsRed трансгентэй эрэ шумуулнуудые урид тодорхойлһон байна.
Албадан ниилүүлхэ туршалгануудые урид тодорхойлһон протоколнуудай ёһоор үнгэргэһэн байна. Байгаалиин ниилэлгын түлөө 4 хоногой онгон эмэ амитадые бэлгын харилсаанда болбосорһон онгон эрэ амитадтай 1:3 харисаагаар хоёр һүниин туршада байлгаһан байна. Эрэ амитадта dsEPP таряаһан туршалгануудта хамтын тор тарилгаһаа хойшо 3-4 үдэртэй тааралдаһан, фазагай үйлэ ажаллалгые дээдын хэмжээгээр намдуу болгоһон үедэ (Үргэдхэгдэһэн мэдээсэл Зур. 2б).
Шумуулнуудай эд, үлэһэн бэе (бэеын бусад хуби) гү, али бүхы бэе 100% метанол болгон задалжа, шүрбэһөөр (2 мм шэл шүрэ, 2,400 эргэлтэ/мин, 90 сек) гомогенизацилагдаһан байна. Эдэй хэмжээ ба метанолой эзэлхүүн иимэ байгаа: бэеын үлэһэн хуби, 500 μl, 100 μl; МАГ, 50–100 80 мкл; эмэ LRT, 25–50 80 μl. Тунамал адли хэмжээнэй метанолтой хоёрдохи метанолой экстракцида ороһон байна. Эсэй хог хаягдалые центрифугировалжа зайлуулһан. Хоёр экстракциин метанолые ниилүүлжэ, азотой гүйдэл доро хатаажа, удаань бэеын уһанда 80% метанолой хэмжээгээр дахин суспендироваһан: μl, 50 μl; MAGs ба эмэгтэй LRT, 30 μl.
Дээжые масс-спектрометр дээрэ (ID-X, Thermo Fisher) LC хэрэгсэлтэй (Vanquish, Thermo Fisher) холбоһон шэнжэлһэн байна. 5 мкл дээжые 3 мкм, 100 × 4.6 мм колонкодо (Inspire C8, Dikma) таряад, 25 °C температурада байлгаһан байна. (уһан, 0.1% мэрээшэнэй хүшэлтүрэгшэ) ба В (ацетонитрил, 0.1% мэрээшэнэй хүшэлтүрэгшэ). LC градиент иимэ байгаа: 5% В 1 минутын туршада, удаань 11 минутын туршада 100% В хүрэтэр нэмэгдэбэ. 100%-да 8 минутын һүүлдэ 5% В минутын туршада баганае дахин тэнсүүлхэ. min-1.MS эхинэй ионизаци эерэг ба сүлөөтэ горимоор халаагдаһан электрошүршүүрэй ионизациар бэелүүлэгдэдэг.
Масс-спектрометр m/z диапазоной 350-һаа 680 хүрэтэр 60,000 нягтабаритайгаар дүүрэн MS горимоор хэмжэнэ.MS/MS мэдээсэлые [M + H]+ (бүхы зорилгонууд), [M - H2O + H]+ (бүхы зорилгонууд), ба [M - H]- (фосфорилированна зорилгонууд/MS/MS дансануудые зорилгын шэнжэ шанарые баталхын тулада хэрэглэһэн) дээрэ абаһан байна. стандарт үгы байгаа. Зорилгото бэшэ экдистероидуудые элирүүлхын тулада >15% харисангы элбэгтэй бүхы HPLC орьёлнуудай MS/MS дансануудые шэнжэлһэн байна. эрэ. 3D20E-дэ иимэ нэмэлтэнүүдэй суглуулбариие хэрэглэн тоосоолһон байна: [M + TFA]-, [M + COOH]-, [M + Na]+, [M + Cl]-, [M + NO3]-.Мэдээллые Tracefinder (4.1-дэхи хубилалта) хэрэглэн гаргажа, тоосоолһон байна.MS/MS-эй мэдээнүүдые XMS-ээр шэнжэлһэн байна. E, 20E ба 3D20E спектрнүүдые тус тусдаа стандартнуудтай зэргэсүүлһэн байна.3D20E22P-ые Жирардын реагентаар деривативизациин аргаар шэнжэлһэн байна.20E22P-ые m/z харисаагаар шэнжэлһэн байна.
3D20E22P MAG-һээ сэбэрлэгдэһэн байна. Сэбэрлэлгэ шэнжэлэлгын хэмжээндэ ультра-гүйсэдхэлэй шэнгэн хроматограф (Acquity, Waters) хэрэглэн, квадруполь массада һуурилһан илгаруулагшатай (QDa, Acquity, Waters) HPLC-MS/MS шэнжэлэлгын адли LC нөхцөлд хэгдэһэн байна. 3D20E22P уридшалан тодорхойлһонтой адли хадгалха сагта элирүүлэгдэһэн байна. Удаань абтаһан нэгэдэлнүүдэй арюун сэбэрые дээрэ тодорхойлһон ёһоор HPLC-MS/MS-ээр шалгаһан байна.
Ниитэ РНК-ые 10-12 үржэхэ эдһээ гү, али бэеын бусад хэһэгүүдһээ (толгойгүй) үйлэдбэрилэгшын заабариин ёһоор TRI реагент (Thermo Fisher) хэрэглэн гаргажа абаһан байна. РНК-ые TURBO DNase-ээр (Thermo Fisher) эмшэлһэн байна. cDNA-ые Moloney murine leukemia reverse transcript (Thermo Fisher; Фишер) үйлэдбэрилэгшын заабариие дагажа.Урбуу транскрипциин тоогой ПЦР-эй праймернууд (RT-qPCR; Extended Data Table 2) урид хэблэгдэһэн24 гү, али Primer-BLAST26 хэрэглэн зохёогдоһон, 70-150 bp хэмжээтэй, экзон-экзон холбоонуудые хамарһан бүтээгдэхүүндэ илгаатайгаар үгтэһэн, гү, али гурбан тусгаарлагдаһан дээжэһээ гурбан тусгаарлагдаһан праймер DNA праймернууд. биологическа репликацинуудые RT-qPCR-эй түлөө уһанда дүрбэн дахин шэлжүүлһэн байна. 1× PowerUp SYBR Green Master Mix (Thermo Fisher), праймернууд, 5 мкл шэлжүүлһэн кДНК-тай 15 мкл репликациин реакцинуудта тоосоолол хэгдэһэн байна. суглуулагдажа, Design and Analysis (2.4.3 хубилалта) хэрэглэн шэнжэлэгдэһэн байна. Энэ шэнжэлэлгын харуулһанаар, харисангы хэмжээнүүдые RpL19 (AGAP004422) рибосомын гендэ нормализацилһан, тэрэнэй илгарал шуһаар тэжээхэ 27 гү, али ниилэхэ 3 -да ехээр хубилдаггүй.
РНК-гай шанарые Agilent Bioanalyzer 2100 Bioanalyzer (Agilent) хэрэглэн шалгаһан байна. Illumina хос һүүлтэй номой сангуудые MIT болон Гарвардай Broad Institute-да бэлдэжэ, ажаллуулжа байгаа. Секвенировалгын уншалгануудые A. gambiae геномтой (PEST штамм, 4.12-дохи хубилалта) HISAT-ые хэрэглэн тааруулһан байна (2025). параметрнүүд. Зураглалай шанартай (MAPQ) сэгнэлтэ <30-тай уншалгануудые Samtools (1.3.1 хубилалта) хэрэглэн усадхаһан байна. Генүүдтэ харуулһан уншалгануудай тоо htseq-count (0.9.1 хубилалта) хэрэглэн стандартна параметрнүүдтэй тоолоһон байна. Нормализацилагдаһан уншалгануудай тоо тоосогдожо, дифференциальна генэй илгарал шэнжэлэгдэһэн (Deq2 Seq 1.28.1) R-дэ (4.0.3-дахи хубилалта).
Экдизон хубилгадаг генэй кандидатнуудые анха PSI-BLAST алгоритм (https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/2.8.1/) хэрэглэн A. gambiae геномые бэдэржэ, стандарт сэнгүүдые хэрэглэн элирүүлһэн байна. NP_001038956.1), Musca domestica (XP_005182020.1, XP_005175332.1 ба XP_011294434.1) ба Microplitis demolitor (XP_00855264661 ба XP_00518202055) B. mori (NP_001036900), Drosophila melanogaster (NP_651202), Apis mellifera (XP_394838) ба Acyrthosiphon pisum (XP_001947166); ба B. mori-һаа EPP (Нэбтэрүүлгын дугаар XP_001947166) NP_001177919.1 ба NP_001243996.1) ба D. melanogaster-эй EO (Нэбтэрүүлгын дугаар NP_572986.1) (алхам 1). Удаань, mRNA-гай үндэр илгарал дээрэ үндэһэлһэн шүүгшэ (10> Гамбиин үржэхэ эд эстэ (эмэгтэй LRT гү, али MAG) нэгэ сая карта дээрэ харуулһан уншалгада (FPKM) гү, али >85%) фрагмент/килобаза экзонууд (2-дохи алхам). Тодорхой байдалые һайжаруулхын тулада бидэ A. albimanus-ай үрэжүүлгын эд эстэ илгаруулагдадаг кандидат ферментнүүдые шэлэжэ абаабди, энэнь ниилэлгын үедэ экдизон синтезлэхэгүй гү, али дамжуулдаггүй анофел зүйл юм. шүүгшэ (4-дэхи алхам), кандидат генүүд иимэ зүйлнүүдэй ядахын хэрээр нэгэниие хангаха ёһотой: (1) дифференциальна илгарал генүүдэй шэнжэлэлгын ёһоор ниилэлгын һүүлдэ мэдэгдэхээр дээшэлүүлэгдэһэн (P < 0.05) ба (2) үрэжүүлгэгүй эдүүдтэ (< 85 % гү, али <100 FPKM).
Бидэ урид тодорхойлһон аргануудые 28,29,30 бүхэли организмын изотопуудай тэмдэглэлые олохын тулада хубилгаабди. Тобшохоноор хэлэбэл, зэрлиг түхэлэй Saccharomyces cerevisiae II түхэлэй (YSC2, Sigma) мёдной азотын һуурида (BD Difco, DF0335) агуулһан (wt/vol) %2 глюза (Ggma, Sigma, 275%) туршагдаа. аминохүшэлгүй ба аммониин сульфат. үрэжүүлгын оршон) ба 5% 15N аммониин сульфат (NLM-713, >99%, Cambridge Isotope Laboratories) азотой ганса эхи һэн. Мөөгөнцөрые центрифугировалжа оложо, шумуулнуудай авгалдай хүүхэлдэй болотор ad libitum тэжээжэ байгаа. үхэл. Гансал эмэ амитадые тэмдэглэгдээгүй эрэ амитадтай ниилэлгын туршалгануудта хэрэглэжэ, ниилэлгын үедэ дамжуулагдаһан эрэ протеомые шэнжэлһэн байна.
4-6 хоногой 15N-тэмдэгтэй онгон эмэ амитадые наһандаа таараха тэмдэггүй онгон эрэ амитадтай ниилүүлхэ баатай болгоо. Амжалтатай ниилэлгэ эпифлуоресценциин микроскопоор ниилэхэ залгуурнуудые элирүүлжэ шалгаһан байна. 3, 12, ба 24 hpm-да 45-55 эмэ амитадай тосхонуудые 50 μl аммоний болгон хубааһан байна. бикарбонат буфер (рН 7.8) ба шүрбэһөөр гомогенизацилагдаһан. Гомогенат центрифугировалагдаһан ба супернатантые 50 мкл 0.1% RapiGest (186001860, Waters) 50 мМ аммониин бикарбонат соо холиһон. Супернатант ба гранулые дээжэ бүхэнһөө дэлбэрһэн ба хүйтэн дээрэ шэрүүнээр эльгээһэн Вашингтоной университедэй МакКосс лабораторидо ошожо, тэндэ LC-MS/MS-дэ дээжые бэлдэхэ ажал дүүргэгдэбэ. 50 мМ аммониин бикарбонат соо 0.1% RapiGest-эй 50 мкл соо гранулые дахин суспендироваад, уһанай ваннада соникировална. Гранула ба супернатант уураг концентрациие BCA шэнжэлэлгээр хэмжэжэ, дээжэнүүдые 50 мМ аммониин бикарбонат соо багадхаһан байна (DTT; Sigma), 15 мМ йодацетамид (Sigma)-тай алкилировалагдажа, 37 °C-та (1:0 50) 1 часай туршада трипсинизацитай: трипсин:субстрат харисаагаар инкубаци хэгдэһэн байна. 14,000 rpm 10 минутын туршада 4 °C-та хог хаягдалые зайлуулха. Дээжые хоёр аргаар хатуу фазын экстракциар (Oasis MCX картриджууд, Waters) угаагаад, 0.1% мэрээшэнэй хүшэлтүрэгшэдэ 0.33 μg μl-1 уураг концентрацитай болгохын тулада дахин суспендироваһан байна. эрэгтэйшүүл.Дээжэ бүхэндэ хоёр шэнжэлэлгын дабталга шэнжэлэгдээ. Удаань 25-см-эй 75-мкм-эй шэлжэһэн кремнийтэй колонкотой 4-см-эй шэлжэһэн кремнийтэй Kasil1 (PQ) фрит урьһаламжатай Jupiter C12 урбуу үеын давирхайгаар (PQ) ба шэнгэн 10-тай (PQ) дүүргэгдэһэн 1 мкг тус бүриие шэнжэлһэн байна. хроматографи. Дээжын дайджест – MS/MS Q-Exactive HF масс-спектрометр дээрэ (Thermo Fisher) nanoACQUITY UPLC System (Waters)-тай гүйсэдхэгдэһэн байна. Гүйсэдхэл бүхэндэ үүсхэгдэһэн мэдээсэлтэй холбоотой олзоборилгын мэдээсэлые Proteowizard (3.0.2027-дахи хубилалта) хэрэглэн mzML формат руу хубилгаһан ба Comet (3.2027-дохи хубилалта) хэрэглэн Anopheles gambiae (VectorBase 54-дэхи хубилалта), Anopheles coluzzi уурагуудай дараалалнуудые агуулһан FASTA мэдээсэлэй сан Mali-NIH (VectorBase 54-дэхи хубилалта), Saccharomyces cerevisiae (Uniprot, 2021 оной 3 һара), A. gambiae RNA-seq, хүнэй мэдээжэ бузарлагшадай гурбан трансляциин хүрээ дээрэ бэдэрэлгэ хэгдэһэн байна. картада тааруулһан FDR-үүдые Percolator32 (3.05-дахи хубилалта) хэрэглэн 0.01-эй босоо хэмжээгээр тодорхойлһон, тиигээд пептидүүдые Limelight33-да (2.2.0-ай хубилалта) уураг парсимони хэрэглэн уураг таниха аргаар суглуулһан. Харисангы уураг элбэг байдалые уридшалан тодорхойлһон NSAF-да гүйдэл бүхэндэ тоосоолһон нормализацилагдаһан спектральна элбэг дэлбэг байдалай коэффициент (NSAF) хэрэглэн тодорхойлһон байна. уураг бүхэндэ харисуулан хоёр ондо ондоо биологическа дабталгаһаа абтаһан дээжэнүүдээр дунда зэргээр абтаһан байна.15N тэмдэглэлгэ эмэгтэй протеомые амжалтатайгаар нюуһан, тиигэбэшье тэмдэглэгдэһэн онгонһоо багахан хэмжээнэй тэмдэглэгдээгүй уураг элирүүлэгдэһэн байна. Бидэ эрэгтэй уураг үсөөрэлые (1-5 спектр) гансал эмэгтэй түүхэй дээжэнүүдтэ тэмдэглэбэбди, эндэ түүхэй дээжэ/эрэгтэй дээжэ абаһанай һүүлдэ дээжые, ВЭЖХ-гай “дамжуулха” үрэ дүндэ. Тэмдэглэгдэһэн онгонһоо 'бузарлагша' гэжэ олоһон хаа-яа уурагуудые нэмэлтэ таблица 1-дэ жагсааһан байна.
Хоёр антигеннэ пептидүүд, QTTDRVAPAPDQQQ (изотип PA дотор) ба MESDGTTPSGDSEQ (изотип PA ба PB дотор). Эдэ хоёр пептидүүдые нэгэдхэжэ, удаань зөөгшэ уураг KLH-тай конъюгировалжа, Шэнэ Зеландида туулайнуудта таряа. сэбэрлэлгэ.Эгээл EPP-тодорхой туулайһаа IgG-ые саашадаа вестерн-блоттинг хэхэдээ хэрэглэбэ.
Вестерн-блот хэхэдээ, MAG (n = 10, эндэ n биологическа бэеэ дааһан шумуулнуудай дээжэнүүдэй тоо) ба эмэ LRT (n = 30) 4 хоногой онгон эрэ ба онгон гү, али хүсөөр ниилэһэн эмэ (<10 ниилэлтын һүүлдэ), Уураг экстракциин буфер (50 мМ Tris, pH 80; 10%; натриин дезоксихолат; 150 мМ NaCl; 1 мМ EDTA; 1× протеаза дарангылагшын коктейль (Roche)) тусгаар нэмэгдэбэ. °C-та. Уурагуудые Брэдфордой шэнжэлэлгээр (Bio-Rad) тодорхойлһон байна. Удаань 20 мкг MAG уураг, 40 мкг LRT уураг, 20 мкг үлэгдэл уурагые денатурировалжа, MOPS буфер хэрэглэн 10% Bis-Tris NuPAGE-ээр тусгаарлаһан байна. дамжуулха системэ (Thermo Fisher). Мембрануудые 1× PBS-T (0.1% Tween-20 PBS-дэ) хоёр дахин угаагаад, удаань Odyssey блокировалгын буфертэ (Li-Cor) 22°C-та 1 часай туршада хааһан байна. буфер) ба хулгана анти-актин моноклональна анханай эсэргүү бодос MAC237 (Abeam; 1:4,000). Мембрануудые PBS-T-ээр угаагаад, удаань хоёрдохи эсэргүү бодосуудаар (элжэгэнэй анти-туулай 800CW ба ямаанай анти-хулгана 680LT (Li-Cor), хоюулаа 1:2000, 100% буфер агуулһан) инкубаци хэбэ. SDS ба 0.2% Tween -20 22 °C-та 1 часай туршада. Мембрануудые PBS-T-ээр угаагаад, Odyssey CLx сканераар зураглана. Зурагуудые суглуулжа, Image Studio-до (5.2-дохи хубилалта) болбосоруулаа. EPP-RA изоформодо (82 кДа) таараһан тусхай бүһэ элирүүлэгдээгүй.
EPP-эй кодировалха бүһэ нютагууд (гистидин фосфатазын домен агуулһан AGAP002463-RB изоформ, NCBI-гай хадгалагдаһан домен бэдэрэлгэ 34) ба EcK2 (AGAP002181) pET-21a(+) плазмида (Novagen Millipore Sigma) клонировалагдаһан; праймернууд үргэдхэгдэһэн мэдээсэлэй таблица 2-до жагсаагдаһан байна. pET-21a(+)-EcK2 конструкциин C-усадхалай 6xHis тэмдэгэй урда найман GS4 холбогшо (тандем) оруулагдаһан байна. NEBExpress эсгүй E. coli уураг синтезэй урбалые хэрэглэн рекомбинантна уурагуудые үйлэдбэрилһэн байна (New England BioLabs BioExpress уурагуудые сэбэрлэһэн NEBExpress уурагуудые хэрэглэн). Ni spin columns (New England BioLabs). Дигидрофолат редуктаза (DHFR) хяналтын уурагые NEBExpress Cell-Free E. coli Protein Synthesis Kit-һээ ДНХ-эй загбарые хэрэглэн үйлэдбэрилһэн байна. Уурагуудые 50% глицерин соо PBS-дэ -20 °C-та 3 һара хүрэтэр хадагалһан байна.
ЭПП ба эдэй экстрактын фосфатазын эдэбхи 4-нитрофенилфосфат (pNPP; Sigma-Aldrich) хэрэглэн хэмжэгдэһэн байна. Реакциин буфер соо 25 мМ Tris, 50 мМ уксусай хүшэлтүрэгшэ, 25 мМ Bis-Tris, 150 мМ NaCl, 10 мМ MTA ба 10 мМ ED байгаа. DTT. Эдые реакциин буфер соо гомогенизацилжа, эсэй хог хаягдалые центрифугировалжа зайлуулһан байна. 2.5 мг мл-1 pNPP агуулһан реакциин буфертэ фермент гү, али эдэй экстракт нэмэжэ реакциие эхилүүлһэн байна. элдэб сагта 405 нм-эй шэнгээхэ шадабари.
In vitro EcK эдэбхитэй байхын тулада уурагые 0.2 мг 20E гү, али 3D20E-тэй 200 мкл буфертэ (рН 7.5) 10 мМ HEPES–NaOH, 0.1% BSA, 2 мМ ATP ба 10 мМ MgCl2 27 °C-да 27 °C-да инкубаци хэбэ. 800 мкл метанол, удаань -20 °C-та 1 часай туршада хүйтэрүүлээд, удаань 20,000 г-да 10 минутын туршада 4 °C-та центрифугировална. Удаань супернатантые ВЭЖХ-МС/МС-ээр шэнжэлһэн байна. Хяналтын бүлэгтэ хэрэглэгдэһэн уурагуудые дулаанаар эдэбхигүй болгохын тулада уурагуудые 20 мкл BS-тэ 20 мкл-да инкубаци хэгдээ 95°C.
In vitro EPP эдэбхитэй байхын тулада уурагые 3D20E22P (18 хос MAG-да олоһон хэмжээтэй тэнсүү, HPLC-MS/MS-ээр арюудхагдаһан) 100 мкл буфертэ (рН 7.5) 25 мМ Tris, 50 мМ уксусай хүшэлтүрэгшэ, 25 мМ мМ BiTris, 100 мкл агуулһан инкубаци хэгдэһэн байна. NaCl, 0.1 мМ EDTA, ба 1 мМ DTT 27 °C-та 3 часай туршада. Урбалые 400 μl метанол нэмэжэ зогсоожо, -20 °C-та 1 часай туршада хүйтэрүүлжэ, удаань 20,000 g-да 10 минутын туршада 4 °C-та центрифугировалһан байна.
EPP (362 bp), EcK1 (AGAP004574, 365 bp) ба EcK2 (556 bp)-эй ПЦР-эй хэһэгүүдые холимог хүйһэтэй толгойгүй шумуулнуудай бэеһээ бэлдэһэн кДНК-һаа олшоруулһан байна. ПЦР-эй праймернуудые үргэдхэгдэһэн мэдээсэлэй таблица 2-до жагсааһан байна. ПЦР-эй фрагмент pL4440 плазмида дээрэхи урбуулһан T7 промоторнуудай хоорондо оруулагдаһан байна. Плазмид бүтэсэ NEB 5-α компетент E. coli (New England Biolabs)-һаа абажа, хэрэглэхэһээ урид ДНХ-эй дараалалаар шалгаһан байна (Нэмэлтэ мэдээсэлэй дараалал PL4440 плазмида тааруулһан дараалал харагты). pL4440-дэ һуурилһан плазмидаһаа оруулгые олшоруулхада T7 промотор (Үргэдхэгдэһэн мэдээсэлэй таблица 2) хэрэглэгдээ. ПЦР-эй бүтээгдэхүүнэй хэмжээе агарозын гель электрофорезээр баталаа. dsRNA-ые Megascript T7 Transcription Kit (Thermo Fisher) хэрэглэн ПЦР-эй загбарһаа транскрипци хэжэ, уридшалан тодорхойлһон хубилалтануудаар үйлэдбэрилэгшын заабариин ёһоор сэбэрлэбэ.
dsRNA тарилга хэхэдээ, 1,380 нг dsRNA (dsGFP, dsEcK1, dsEcK2, dsEPP) 10 нг nl-1 концентрацитайгаар томо эрэгтэй гү, али эмэ амитадай (Nanoject III, Drummond) сээжэ руу 1 үдэрэй туршада таряа. РНХ-эй абалга, кДНХ-эй синтез, RT-qPCR. Экдизон тарилга хэхэдээ, 4 хоногой онгон гү, али 6 хоногой онгон шуһаар хооллоһон эмэгтэйшүүлдэ 0.13, 0.21, гү, али 0.63 мкг 20E гү, али 3D20E (Narum III) концентрацитай 20E, 0.63 мкг таряа. тус тусдаа, туршалгын түсэбһөө дулдыдажа гү, али 6.3 нг нл-1. 100 нл 10% (об/об) этанол уһанда оруулха; 100 нл 3D20E22P 10% этанол соо (Хос MAG-да олдоһон хэмжээнэй 75%-тай тэнсүү). Шумуулнуудые тарилгын бүлэгтэ санамсаргүйгөөр хубааһан байна.
Үрэжүүлгын шэнжэлэлгын тулада 3 хоногой эмэ шумуулнуудые хүнэй шуһаар ad libitum тэжээбэ. Хэсүүгээр тэжээгдэһэн гү, али тэжээгдээгүй шумуулнуудые усадхаха. Эмшэлгэһээ дулдыдажа, эмэ шумуулнуудые шуһанай эдеэнэй һүүлдэ дор хаяжа 48 часай туршада дүрбэн һүниин туршада тусдаа үрэжүүлгын аяга соо байлгаба. Үндэгэнүүдые стереоскопоор тоолодог байгаа (Steemi, 508); ниилэһэн эмэ амитадта үрэжэлтэй гэжэ тоосогдодог байгаа.
Холбохо туршалгануудта эмэ амитадые эмшэлгэһээ хамааран 2 хоногһоо багагүй хугасаагаар ниилэхэ эсэргүүсэл хүгжөөхэ боломжо олгожо, зэрлиг түхэлэй наһанай таарһан эрэ амитадые нэгэ тор руу оруулһан байна. Хоёр һүниин һүүлдэ эмэ амитадай үрэжүүлһэн везикулые тайража, геномой ДНХ-ые хүлдэхэ-таһалха ба 10 М агуулһан буфер соо соникациин аргаар гаргаһан байна Tris-HCl, 1 мМ EDTA, ба 25 мМ NaCl (pH 8.2). Дээжые 55 °C-та 15 минутын туршада Proteinase K (0.86 μg μl-1)-тай инкубаци хэжэ, удаань 95 °C-та 10 минута үргэлжэлүүлһэн байна. хромосомын дараалалнууд; праймернууд үргэдхэгдэһэн мэдээсэлэй таблица 2-до жагсаагдаһан байна. Y хромосомын дараалал үгы байбал ниилэлтэ үгы гэжэ тэмдэглэнэ.
Дахин ниилэлгын шэнжэлэлгын тулада хүсөөр ниилүүлһэн эмэ амитадые ниилэлгын байдалые баталхын тулада ниилэлгын залгуурнууд байгаа гү гэжэ шалгажа, уридшалан тодорхойлһон ёһоор эрэ амитадай үгы байхада ниилэлгын тэсэбэритэй байдалые хүгжөөхын тулада 2 хоног үгэбэ. эмэ амитадһаа тайража, геномой ДНХ-ые дээрэ тодорхойлһон ёһоор бэлдэжэ, DsRed трансгенэй qPCR илгаруулгада оруулһан; праймернуудые үргэдхэгдэһэн мэдээсэлэй таблица 2-до жагсааһан байна. DsRed трансгенэй үгы байһаниинь дахин ниилэлгэ болоогүй гэжэ харуулна.
3D20E уридшалан тодорхойлһон ёһоор синтезировалагдаһан 37 . Тобшохоноор хэлэбэл, 10 мг 20E (Sigma-Aldrich) 10 мл уһанда уһалагдаһан, удаань 30 мг платина хара (порошок хэлбэритэй, Sigma-Aldrich) нэмэгдэһэн. танхимай температурада. 6 часай һүүлдэ 30 мл метанол нэмэжэ, урбалые зогсообо. Холисо катализаторай хэһэгүүдые зайлахын тулада центрифугировалһан байна. Супернатантые танхимай температурада вакуум соо хатааха хүрэтэр ууршалһан байна. Хатаагдаһан реакциин бүтээгдэхүүниие 10% этанолдо уһалжа, метанолдо уһалжа, HPMS/HPMS хурдадхал шэнжэлэлгын хурдаар тарилга хэһэн байна. (20E-һээ 3D20E хүрэтэр) ойролсоогоор 97% байгаа (Зур. 4б), синтезировалһан 3D20E-эй MS спектр ниилэһэн эмэ амитадта олоһонтой таарана (Зур. 4в).
Домог соо хэгдэһэн статистикын туршалгануудай тусхай дэлгэрэнгы мэдээсэлнүүд бии. GraphPad (9.0 хубилалта) Фишерэй нарин туршалга, Mantel-Cox туршалга, Student's t-тест хэхэдээ хэрэглэгдээ. Cochran-Mantel-Haenszel туршалгануудые тусхай R скрипт хэрэглэн үнгэргэбэ (https://github.com/haenszel/haenszel. Мэдээлэлэй хубаариие туршаһан байна). 0.05-ай удха шанартай босоо хэмжээтэй Шапиро-Вилкын тест хэрэглэн ёһотойл байдалые хангахын тулада. Мэдээлэлнүүдэй ёһотойл тестын үрэ дүнгүй байхадань, Манн-Уитниин тест хэгдээ. Амиды үлэхэ тухай мэдээсэлые Мантель-Кокс тест хэрэглэн шэнжэлһэн байна. дунда зэргые харуулна. Бүхы туршалгануудай босоо хэмжээн болгон P = 0.05 удха шанартай сэн хэрэглэгдээ.
Шэнжэлэлгын түсэб тухай дэлгэрэнгы мэдээсэл абахын тулада энэ үгүүлэлтэй холбоотой Байгаалиин Шэнжэлэлгын Отчетой абстракт харагты.
MS протеомой мэдээсэлнүүдые PRIDE Partner Repository (https://www.ebi.ac.uk/pride/) дамжуулан ProteomeXchange Consortium (http://proteomecentral.proteomexchange.org) руу PXD032157 мэдээсэлэй багтаамжын идентификатортайгаар оруулһан байна.
RNA-seq мэдээсэлэй багтаамжа GSE198665 гэһэн удаадахи тэмдэглэл доро Генэй илгаралгын үргэн дэлисэтэй номой сан (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) соо хадагалагдана.
Мүнөөнэй шэнжэлэлгын үедэ бии болоһон ба/гү, али шэнжэлэгдэһэн нэмэлтэ мэдээсэлэй багтаамжануудые зохёогшодһоо үндэһэнэй эрилтээр абажа болохо. Энэ үгүүлэл эхинэй мэдээсэлые үгэнэ.
Де Лооф, А. Экдистероидууд: Орхигдоһон хорхой шумуулнуудай бэлгын стероидууд? Эрэ хүн: Хара хайрсаг. Хорхой шумуулнуудай эрдэм ухаан.13, 325–338 (2006).
Редферн, CPF 20-гидроксиэкдизон ба Anopheles stephens-эй умайн хүзүүгэй хүгжэлтэ.J. Хорхой шумуулнуудай физиологи.28, 97–109 (1982).