Секреторна замда уураг ангилал эсэй хубаарилалта ба гомеостазые хадгалхада шухала. Бүрхөөлөөр зуучлагдаһан сортын хажуугаар, секретор дамжуулгын үйлэ ябасада кинезинай сортын липидүүдэй үүргэ хадаа үшөө харюу үгтөөгүй удаан хугасаанай үндэһэн асуудал болоно. Эндэ бидэ 3D нэгэ доро олон үнгын үндэр нарибшалалтай бодото сагта зураглал хэжэ, шэнээр синтезлэгдэһэн гликозилфосфатидилинозитол-иммобилизированна уурагуудые тон ута керамид липидэй хэһэгүүдтэй бүлэглэжэ, тусхай эндоплазмын Net exit site гэжэ ангилдаг гэжэ in vivo гэршэлнэбди, энэнь трансмембранна уурагуудһаа илгаатай. Нэмэжэ хэлэхэдэ, эндоплазмын торлог бүрхэбшын мембранада керамидай гинжын ута энэ сортын шэлэн абаха шадабарида шухала гэжэ харуулнабди. Манай шэнжэлэлгэ липидэй гинжын ута дээрэ үндэһэлжэ уураг ашаае секреторна замда шэлэн экспортировалха газарнуудта ангилха түрүүшын шууд in vivo баримта үгэнэ.
Эукариот эсүүдтэ эндоплазмын торлог бүрхэбшэдэ (ER) синтезлэгдэһэн уурагуудые секреторна замаар дамжуулан дамжуулха үедэ зохистой эсэй зорилгодоо хүргэхэ зорилгоор илгаруулдаг (1). Хушалтаар зуучлагдаһан ангилалһаа гадна, зарим липидүүдые тусхай уурагуудта (2-5) тусхай мембран доменуудта бүлэглэжэ, шэлэн гараха сэгынь боложо шадаха гэжэ удаан хугасаанай туршада таамаглаһан байна. Гэбэшье, энэ боломжотой липид дээрэ һуурилһан механизмые гэршэлхэ шууд in vivo баримтанууд үшөөл дутагдалтай байна. Энэ үндэһэн асуудалые шиидхэхэ зорилгоор бидэ дрожжи соо гликозилфосфатидилинозитол (GPI) зангилаатай уурагууд (GPI-APs) ER-һээ илгаатайгаар яажа гарадагые шэнжэлээбди. GPI-APs гээшэ липидтэй холбоотой эсэй гадаргуугай уурагууд ( 6, 7). GPI-AP хадаа гликолипидэй хэһэгээр (GPI зангилаа) дамжуулан плазмын мембранай гадаада хуудаһанда хабсарһан шэлжэһэн уураг юм. Тэдэ GPI зангилаануудые ER люмен соохи консерватив посттрансляционно хубилалтанууд гэжэ хүлеэн абадаг (8). Хабсарһанай һүүлдэ GPI-AP Гольджиин аппаратаар (5, 9) ER-һээ плазмын мембрана хүрэтэр дамжан ородог. GPI зангилаануудай байрлалга GPI-AP-ые трансмембран шүүрэлтэ уурагуудһаа (энэ тоодо бусад плазмын мембран уурагууд) тусгаарлан шүүрэлэй замаар дамжуулдаг (5, 9, 10). Мөөгөнцөрөй эсүүдтэ GPI-AP-ууд эндоплазмын торлог бүрхэбшын бусад шэлжэһэн уурагуудһаа тусгаарлагдажа, удаань бүрхөөлэй уураг комплекс II (COPII)-ээр орёогдоһон онсогой везикулнуудта бообологдоно (6, 7). ER экспортын үйлэ ябасада энэ ангилалгын үйлэ ябасын тодорхойлогшод тодорхой бэшэ, харин энэ механизм липидүүдые, илангаяа GPI зангилаанай липидэй хэһэгэй бүтэсэ шэнэлхэ шаардалгатай байжа болохо гэжэ таамагладаг (5, 8). Мөөгөнцөртэ GPI-эй липидэй шэнэлэлтэ GPI-эй нягтарһанай дараа дары эхилдэг ба олон ушарта энэнь керамидые 26-нүүрһэнтүрэгшын ута гинжэтэ ханаһан тоһон хүшэлтүрэгшэтэй (C26:0) холбодог (11, 12). C26 керамид хадаа мёдной эсүүдэй үйлэдбэрилһэн гол керамид юм. Энэнь ER-дэ синтезлэгдэдэг ба ехэнхинь COPII везикулнуудаар дамжуулан Гольджиин аппарат руу экспортировалагдадаг (13). GPI-AP-эй ER экспорт тусхайлан үргэлжэлһэн керамид синтез шаардана (14, 15), тиигээд өөрынгөө эрьесэгээр Гольджиин аппарат соо керамидые инозитол фосфат керамид (IPC) болгожо хубилгаха гээшэ GPI зангилаа синтезһээ дулдыдана (16). Хиймэл мембранаар хэһэн биофизикын шэнжэлэлнүүдэй дүнгөөр, тон ута ацил гинжэтэ керамидууд ниилэжэ, онсогой физикын шэнжэтэй эмхитэй доменүүдые бии болгожо шададаг (17, 18). Эдэ мэдээнүүд C26 керамид ба C26 керамидтай GPI-AP өөрынгөө физикын шэнжэ шанарые хэрэглэн харисангы бузар ER мембранай липидэй оршон байдалда эмхитэй бүһэ нютагуудта гү, али бүһэ нютагуудта нэгэдэнэ гэһэн таамаглалые үүсхэнэ. Энэнь гол түлэб богони ба ханаагүй глицеролипидүүдһээ (C16:1 ба C18:1) бүридэнэ (19, 20). Эдэ бүһэ нютагууд тусхай ER гараха газарнуудта (ERES) шэлэн шэглүүлэгдэхэ, тэндэ керамид ба керамид дээрэ һуурилһан GPI-AP нэгэ тусхай COPII везикул соо Гольджи руу хамта дамжуулагдаха аргатай (5).
Энэ шэнжэлэлгын үедэ бидэ энэ липид дээрэ һуурилһан механизмые супер-нарибшалалтай конфокальна бодото сагта дүрсэлэлгын микроскоп (SCLIM) хэрэглэн шууд туршаһан байнабди, энэнь флуоресцентнэ тэмдэгтэй уурагуудые нэгэ доро ажаглаха аргатай оршон үеын микроскопиин арга юм.
Бидэ анха SCLIM технологиие хэрэглэн, S. cerevisiae-да ER-һээ гараһанай дараа C26 керамид бүлэгтэй хэб маягай GPI-AP-ые трансмембран шүүрэлтэтэй уурагуудһаа яажа шалгаһан тухай саашань тодорхойлбобди. ER-эй ангилалые шалгахын тулада бидэ ERES-дэ in vivo орожо байһан шэнэ синтезировалһан ашаае шууд харуулха генетикын системые хэрэглээбди (7, 23). Ашаа болгон бидэ ногоон флуоресцентнэ уураг (GFP) тэмдэглэгдэһэн C26 керамид дээрэ һуурилһан GPI-AP Gas1 ба ойролсоогоор инфраулаан флуоресцентнэ уураг (iRFP) тэмдэглэгдэһэн трансмембранна секретированна уураг Mid2 шэлэжэ абаабди, эдэ хоюулаа плазмын мембранада зорюулагдана (24–26). sec31-1 температурада мэдрэмтгий мутантда эдэ хоёр ашаа галактозо үүсхэгдэдэг промотор болон бүридүүлэгшэ ERES тэмдэглэгшэ доро илгаруулагдадаг. Туйлай температурада (37°C), юундэб гэхэдэ sec31-1 мутаци COPII-эй бүрхөөлэй компонент Sec31-эй COPII-эй ургаха болон ER-эй экспортые дараха үйлэ ажаллалгада нүлөөлдэг тула шэнэ синтезировалһан ашаа ER-дэ суглардаг (23). Бага температурада (24°C) хүйтэрүүлһэн хойно sec31-1 мутант эсүүд секреторна газарһаа һэргэжэ, сугларһан шэнэ синтетик ашаа ER-һээ гаргагдажа эхилһэн байна. CLIM-эй үзэгдэл шэнээр синтезлэгдэһэн Gas1-GFP ба Mid2-iRFP-эй ехэнхинь 37°C-та инкубаци хэһэнэй удаа sec31-1 мутант эсэй ER-дэ сугларжа, 24°C-та 5 минутын туршада гаргагдаһан байна (Зураг 1). Mid2-iRFP бүхы ER мембран дээрэ тараагдаһан, Gas1-GFP ER мембранай таһаралтагүй газарта түблэржэ сугларһан тула тэдэнэй хубаари огто ондоо (Зураг 1, А-һаа С хүрэтэр ба Movie S1). Нэмэжэ хэлэхэдэ, 1D зураг дээрэ харуулһандал, Gas1-GFP кластер Mid2-iRFP үгы. Эдэ дүнгүүд GPI-AP ба трансмембранна уурагуудые эртэ ондо ондоо ER мембранай бүһэ нютагуудта хубааһан гэжэ харуулна. Gas1-GFP кластер mCherry-н COPII бүрхөөлэй уураг Sec13-тай тэмдэглэгдэһэн тусхай ERES-тэй зэргэлээд байна (Зураг 1, E ба F, ба S1 кино) (23).
sec31-1 эсүүд галактозоор үүсхэгдэһэн шүүрэлые илгаруулдаг, ута ацил гинжэтэй (C26) керамид GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, ногоон) ба трансмембранна уураг Mid2-iRFP (TMP, хүхэ) ба энэ Конструктивна ERES тэмдэглэлгэ Sec13-mCherry (E) 30°C-да магнитировалагдаһан байна минута, 24°C хүрэтэр абаашажа, 5 минутын һүүлдэ SCLIM-ээр зураг абаһан. (А-һаа С хүрэтэр) хабтагайн ниилмэл гү, али ганса 2D дүрсэ (А), 10 z-секциин 2D проекциин дүрсэ (В) гү, али ашаанай ба ERES тэмдэглэгшэдэй 3D эсэй хахад бүмбэрсэгэй дүрсэ (С) харуулна. Хэмжээ 1μm (A ба B). Хэмжээнэй нэгэдэл 0.551μm (C). Gas1-GFP тусгаар ER бүһэ нютагуудта гү, али кластернуудта элирүүлэгдэһэн, харин Mid2-iRFP элирүүлэгдэһэн ба ER мембранаар тараагдаһан (C). (D) График сагаан һумаар (зүүн) Gas1-GFP кластер соо Gas1-GFP ба Mid2-iRFP-эй харисангы флюоресценциин эршэм хүсэн харуулна. AU, дурын нэгэдэл. (E ба F) бараа ба ERES тэмдэгые нэгэдүүлһэн 3D дүрсэ харуулна. Gas1-GFP кластернууд тусхай ERES-эй дэргэдэ элирүүлэгдэһэн байна. Хэмжээнэй нэгэдэл 0.551μm. (F) Сагаан хатуу сум ERES-тэй холбоотой Gas1-GFP кластерые тэмдэглэнэ. Дунда ба баруун панелнүүд ниилүүлһэн томо болгоһон 3D зураг ба шэлэгдэhэн Gas1-GFP кластерай эрьюулэгдэһэн хараса харуулна.
Gas1-GFP кластер ба тусхай ERES хоорондын нягта орон зайн холбоо Gas1-GFP шэлэн ERES-дэ орожо шадаха гэжэ харуулна, энэнь Mid2-iRFP-эй ER-һээ гарахада хэрэглэдэг шэлэн абаха шадабариһаа илгаатай. Энэ боломжые шиидхэхэ зорилгоор бидэ гансал нэгэ гү, али хоёр бараанай ERES харисаае тодорхойлбобди (Зураг 2, А-һаа С хүрэтэр). Ехэнхи ERES (70%) гансал нэгэ түхэлэй ашаа агуулдаг гэжэ бидэ олообди. Зураг 2С-эй доодо зураг дээрэ гансал Gas1-GFP (Зураг 1) гү, али гансал Mid2-iRFP (Зураг 2)-тай ERES-эй хоёр жэшээ харуулагдана. Харин ERES-эй ойролсоогоор 20%-нь нэгэ газарта дабхарлаһан хоёр ашаатай. Зарим ERES (10%) хоёр янзын ашаа агуулдаг гэжэ элирүүлэгдээ, зүгөөр тэдэ тодорхой ондо ондоо газарнуудта тусгаарлагдаһан байгаа. Тиимэһээ энэ статистикын шэнжэлэл ER-ые экспортировалһанай һүүлдэ GPI-AP Gas1-GFP ба трансмембранна ашаа Mid2-iRFP ондо ондоо ERES-үүдтэ хубаагдана гэжэ харуулна (Зураг 2D). Энэ ангилалгын үрэ дүн урданай биохимиин шэнжэлэлтэй (6) ба морфологическа тодорхойлолтотой (7) тон тааруу байна. Мүн ERES-дэ орожо байһан карантинда байһан ашаанай абари зан ажаглажа болоно (Зураг 2Е ба S2 кино). 2Е зураг дээрэ Gas1-GFP (3-дахи панель) гү, али Mid2-iRFP (4-дэхи панель)-эй гансал багахан хубинь ERES-дэ нэгэ талаһаа орожо, тусгаар газарта хаагдаһан байна. 2Е зурагта 5-дахи панел дээрэ Gas1-GFP ба Mid2-iRFP заримдаа нэгэ ERES-дэ байдаг, зүгөөр тэдэ ондо ондоо талаһаа орожо, ондо ондоо COPII везикулнуудые тэмдэглэжэ болохо тусдаа бүһэ нютагуудта түблэрдэг. Мүн C26 керамид дээрэ һуурилһан GPI-AP Gas1-эй шэлэн абаха ERES гэжэ илгарал ба ангилал тусхай гэжэ баталаабди, юундэб гэхэдэ үшөө нэгэ трансмембранна секрециин ашаа, GFP-тэмдэгтэй плазмын мембран уураг Axl2 (27 ), Mid2-iRFP-тэй адли абари зан харуулна. (S1 зураг ба S3 кино). Шэнэ синтезировалһан Axl2-GFP Mid2-iRFP мэтэ ER мембранаар тараагдадаг (Зураг S1, A ба B), ба ехэнхи ERES-дэ Mid2-iRFP-тэй хамта локализацилагдадаг (Зураг S1, B-һээ D хүрэтэр). Зураг 1-эй 1 ба 2-дохи панелнүүд. S1C хоёр трансмембранна ашаанай дабхарлаһан ERES-эй хоёр жэшээ харуулна. Эдэ ушарнуудта хоёр бараа ERES-дэ хамта ородог (Зураг S1E, Панель 3 ба Movie S3).
Галактозо үүсхэгдэдэг шүүрэлые илгаруулдаг sec31-1 эсүүдые, Gas1-GFP (GPI-AP, ногоон) ба Mid2-iRFP (TMP, хүхэ) ба Sec13-mCherry (ERES, магент) тэмдэглэһэн бүридүүлэгшэ ERES-ые 37 °C-та 30 минутын туршада инкубаци хэһэнэй удаа 24 °C-та инкубаци хэһэнэй удаа 24-дэ табижа, шүүрэлые хаажа, ион руу шэлжүүлһэн байна SCLIM-тэй 20 минутын һүүлдэ. (А-һаа С хүрэтэр) ERES-ээр тэмдэглэгдэһэн ашаанай ба 10 z-хэсэгүүдэй түлөөлһэн 2D проекциин дүрсэнүүд (А; масштабай зурлаа, 1μm) гү, али 3D эсэй хахад бүмбэрсэгэй дүрсэнүүд (B ба C; масштабай нэгэдэл, 0.456μm). (B)-дэхи доодо панел ба (C)-дэхи панель гансал ERES (магент) [Gas1-GFP (саарал) ба Mid2-iRFP (хүхэ)]-да байһан бараа харуулхын тулада болбосоруулһан зурагуудые харуулна. (C) Нээмэл һумаар: ERES гансал нэгэ ашаа (1-һээ 4 хүрэтэр) абажа ябадаг. Саарал һумаар: ERES тусгаарлагдаһан ашаа (5) агуулна. Сагаан хатуу һумаар: хамта байрладаг ашаатай ERES. Дооро: Шэлэгдэhэн ганса ERES гансал Gas1-GFP (1) гү, али Mid2-iRFP (2) агуулна. Хэмжээнэй зурлаа, 100 нм. (D) (C)-дэ тодорхойлһон фотомикрографын тоосоолол. Гансал нэгэ ашаа (Gas1-GFP гү, али Mid2-iRFP), тусгаарлагдаһан ашаа ба дабхарлаһан ашаа агуулһан ERES-эй дунда зэргын хуби. Гурбан бэеэ дааһан туршалгануудта 54 эстэ n=432. Алдуугай зурлаа = SD. Хоёр һүүлтэй хосгүй t тест. *** P = 0.0002. (E) (C) тэмдэгтэй карантинда байһан ашаанай шэлэгдэhэн ERES-эй 3D зураг. Gas1-GFP (ногоон) (3) гү, али Mid2-iRFP (хүхэ) (4) нэгэ талаһаа ERES (магента) руу орожо, ERES доторхи багахан газарта хизаарлагдадаг. Заримдаа, хоёр түрэлэй ашаа нэгэ ERES (5) нэгэ талаһаа орожо, ERES дотор тусгаарлагдамал газарта хаагдадаг. Хэмжээнэй зурлаа, 100 нм.
Удаань, бидэ ER мембранада байһан ута ацил гинжын керамид (C26) Gas1-эй тусхай кластеризаци болон шэлэн абаха ERES-дэ илгаруулдаг гэһэн таамаглалые туршабабди. Энэ зорилгоор бидэ хубилгагдаһан GhLag1 мёд хэрэглээбди, энэнь хоёр эндоген керамид синтаза Lag1 ба Lac1-ые GhLag1 (хүбэн Lag1 гомолог)-ээр һэлгэжэ, зэрлиг янзаһаа богони эсэй мембранатай Ceramide штаммтай мёд штамм бии болгоо (Зураг 3А) (288). Масс-спектрометриин (МС) шэнжэлэлгын дүнгөөр ​​зэрлиг түхэлэй штаммуудта ниитэ керамидай 95%-нь ехэ ута (C26) гинжэтэ керамид, харин GhLag1-дэ 85%-нь ехэ ута (C18 ба C16) байдаг. ), гансал 2% керамид ехэ ута (C26) гинжэтэ керамид юм. Хэдыгээр C18 ба C16 керамидууд GhLag1 мембранада одоогоор элирүүлэгдэһэн гол керамидууд байгаашье һаа, MS шэнжэлэлгын дүнгөөр ​​GhLag1 штаммда илгаруулагдаһан Gas1-GFP-эй GPI зангилаа C26 керамид агуулдаг, энэнь зэрлиг түхэлэй липидүүдтэй адлирхуу. Шанар адли (Зур. 3А) (26). Тиимэһээ энэнь керамид шэнэлхэ фермент Cwh43 C26 керамидта ехэ шэлэн абадаг гэһэн удхатай, 26-дахи зураг дээрэ харуулһандал, энэнь GhLag1 штаммда бага хэмжээнэй C26 керамидһаа GPI зангилаае илгаатайгаар оруулдаг. S2 (29). Гэбэшье, GhLag1-эй эсэй мембрана юрэнхыдөө гансал C18-C16 керамид агуулдаг, харин Gas1-GFP үшөө C26 керамидтай. Энэ баримта энэ штаммые ER-дэхи мембран керамидай ацил гинжын утанай асуудалые тусхайтаар шиидхэхэ тон һайн хэрэгсэл болгодог. Ангиин ба ангилалгын таамаглалай үүргэ. Удаань, бидэ нэн түрүүн C26 Gas1-GFP-эй GhLag1-дэ sec31-1-эй температурада мэдрэмтгий мутант аллельтэй кластернуудта сугларха шадабариие юрэнхы флуоресценциин микроскопоор шэнжэлээбди, тэндэ гансал ута (C18-C16) гинжэн ER мембран Ceramide-да бии (Зураг 3). Бидэ sec31-1-дэ Gas1-GFP-эй ехэнхи хубинь кластернуудаар түблэрһэн, харин sec31-1 GhLag1-дэхи Gas1-GFP ута (C18-C16) ута керамид ER мембранатай гол түлэб кластеризацилагдаагүй ба бүхы ER мембранада тараагдаһан байгаа гэжэ ажаглаабди. Тодорхойгоор хэлэбэл, C26 керамид дээрэ һуурилһан кластеризаци тусхай ERES-тэй нягта холбоотой тула (Зураг 1), бидэ удаадахидаа энэ үйлэ ябаса ER-эй экспортын уураг механизмын үүргэтэй байжа болохо гү гэжэ шэнжэлээбди. GPI-AP ER экспортын тусхай COPII системые хэрэглэдэг, энэнь GPI зангилаанай гликан хэһэгэй Ted1-эй бүтэсэ заһабарилгаар эдэбхитэйгээр зохисуулагдадаг (30, 31). Рекомбинантна GPI-гликан удаань трансмембранна ашаанай рецептор p24 комплексоор танигдана, энэнь өөрынгөө эрьесэгээр Lst1-ые шэлэн абадаг, энэнь COPII-эй гол ашаанай холбохо дэд нэгэдэлэй Sec24-эй тусхай изоформ болоод GPI-AP-ээр баялиг COPII-ые бии болгодог. Тиимэһээ бидэ эдэ ганса уурагуудые (p24 комплексын бүридүүлэгшэ Emp24, GPI-гликан шэнэлхэ фермент Ted1 ба тусхай COPII дэд нэгэдэл Lst1) sec31-1 мутант штаммтай усадхаха хоёр дахин мутант бүтээжэ, тэдэниие шэнжэлээбди. Бидэ sec31-1emp24Δ ба sec31-1ted1Δ-дэ Gas1-GFP гол түлэб кластергүй ба бүхы ER мембранаар тархаһан гэжэ ажаглаабди, энэнь урид sec31-1 GhLag1-дэ харагдаһан, харин sec31-1lst1Δ-дэ Gas1-GFP Like sec31-1-11-дэ адли. Эдэ дүнгүүд ER мембранада C26 керамид байхаһаа гадна Gas1-GFP-эй кластеризаци p24 комплекстой холбогдохо хэрэгтэй болоод тусхай Lst1-эй рекрутинг шаарданагүй гэжэ харуулна. Удаань, бидэ ER мембранада керамидай гинжын ута Gas1-GFP-эй p24-тэй холбоое зохисуулха арга боломжые шэнжэлээбди. Гэбэшье, мембранада C18-C16 керамидай байрлалга p24 комплексоор һэргээгдэһэн GPI-гликануудта (S3 ба S4, A ба B зурагууд) гү, али GPI-AP-тай холбогдожо, GPI-AP-ые экспортировалхада нүлөөлнэгүй гэжэ бидэ олообди. шадабари. COPII Lst1 дэд түхэл абаха (Зураг S4C). Тиимэһээ C26 керамидһаа дулдыдаха кластеризаци ER-эй экспортын уураг механизмуудтай уураг харилсан үйлэшэлэлгэ шаарданагүй, харин липидэй утаһаар ударидаһан өөр ангилалгын механизмые дэмжэнэ. Удаань, бидэ ER мембранада керамид ацил гинжын ута Gas1-GFP-ые шэлэн абаха ERES гэжэ үрэ дүнтэй ангилхада шухала гү гэжэ шэнжэлээбди. Богино гинжэтэ керамидтай GhLag1 штаммай Gas1 ER-һээ гаража плазмын мембранада ородог тула (Зураг S5), хэрбээ илгарал керамид ацил гинжын утаһаар хүтэлбэрилэгдэдэг бол GhLag1 штаммай Gas1-ые дахин шэглүүлжэ, гаталжа болохо гэжэ бидэ этигэнэбди. ERES бараа адли мембранатай.
(A) GhLag1-эй эсэй мембрана гол түлэб богони C18-C16 керамидуудые агуулдаг, харин Gas1-GFP-эй GPI зангилаа зэрлиг түхэлэй эсүүдтэй адли C26 IPC-тэй. Дээдэ: зэрлиг түхэлэй (Wt) ба GhLag1p штаммуудай эсэй мембранада керамидай ацил гинжын утанай шэнжэлэлгэ масс-спектрометриин (MS) аргаар. Мэдээлэлнүүд ниитэ керамидэй хубиие харуулна. Гурбан бэеэ дааһан туршалгануудай дунда зэргые. Алдуугай зурлаа = SD. Хоёр һүүлтэй хосгүй t тест. **** P ＜0.0001. Доодо самбар: зэрлиг түхэлэй ба GhLag1p штаммуудта илгаруулагдаһан Gas1-GFP (GPI-IPC) GPI зангилаа соохи IPC-эй ацил гинжын утанай MS шэнжэлэл. Мэдээлэлнүүд ниитэ IPC дохиной хубиие харуулна. Табан бэеэ дааһан туршалгануудай дунда зэргые. Алдуугай зурлаа = SD. Хоёр һүүлтэй хосгүй t тест. ns, шухала бэшэ. P = 0.9134. (B) Галактозоор үүсхэгдэһэн Gas1-GFP илгаруулдаг sec31-1, sec31-1 GhLag1, sec31-1emp24Δ, sec31-1ted1Δ ба sec31-1lst1Δ эсүүдэй флюоресценциин микрографуудые 37°C-та 30 минутын туршада инкубаци хэжэ, флюоресценциин гүйсэдхэл доошолуулһан байна 24°C һүүлдэ микроскопоор. Сагаан һумаар: ER Gas1-GFP кластер. Нээмэл сумаар: ER-эй шэнжэ шанартай ядрогой бэһэлигэй будалга харуулһан бүхы ER мембран дээрэ бүлэглэгдээгүй Gas1-GFP тархаһан байна. Хэмжээнэй зурлаа, 5μm. (C) (B)-да тодорхойлһон фотомикрографын тоосоолол. Gas1-GFP бүтэсэтэй эсүүдэй дунда зэргын хуби. Гурбан бэеэ дааһан туршалгануудта n≥300 эсүүд. Алдуугай зурлаа = SD. Хоёр һүүлтэй хосгүй t тест. **** P ＜0.0001.
Энэ асуудалые шууд шиидхэхэ зорилгоор бидэ sec31-1 температурада мэдрэмтгий мутант аллельтэй GhLag1-дэхи Gas1-GFP ба Mid2-iRFP-эй SCLIM-визуализаци хээбди (Зураг 4 ба Movie S4). ER-ые 37°C-та байлгажа, удаань 24°C-та гаргаһанай һүүлдэ, шэнээр синтезлэгдэһэн Gas1-GFP-эй ехэнхинь ER-эй мембранаар ниилэжэ, тархаһангүй, энэнь юрэнхы микроскопуудаар ажаглагдаа (Зураг 4, А ба В). Нэмэжэ хэлэхэдэ, ERES-эй ехэ хубинь (67%) тэрээн соо хамта байрладаг хоёр янзын ашаае багтаадаг (Зураг 4D). 4С зурагта 1 ба 2-дохи панелнүүдтэ Gas1-GFP ба Mid2-GFP дабхарлаһан ERES-эй хоёр жэшээ харуулагдана. Нэмэжэ хэлэхэдэ, хоёр бараа нэгэ ERES-дэ абтаһан байна (Зураг 4Е, панель 3 ба кино S4). Тиимэһээ манай дүнгүүд ER мембранада керамид ацил гинжын ута ER уураг агрегаци болон ангилалгын шухала тодорхойлогшо гэжэ харуулна.
Галактозоор үүсхэгдэһэн шүүрэлые илгаруулдаг Sec31-1 GhLag1 эсүүд, Gas1-GFP (GPI-AP, ногоон) ба Mid2-iRFP (TMP, хүхэ) ба бүридүүлэгшэ ERES-тэмдэгтэй Sec13-mCherry (ERES, магент) 37°C-та инкубаци хэнэ. минутын туршада үргэлжэлүүлжэ, 24°C хүрэтэр бууруулжа, шүүрэлые гаргажа, 20 минутын һүүлдэ SCLIM-ээр зураг абаха. (А-һаа С хүрэтэр) Ашаа ба ERES-ээр тэмдэглэгдэһэн 10 z-хэсэгүүдэй түлөөлһэн 2D проекциин дүрсэнүүд (А; масштабай зурлаа, 1μm) гү, али 3D эсэй хахад бүмбэрсэгэй дүрсэнүүд (B ба C; масштабай нэгэдэл, 0.45μm). (B)-дэхи доодо панел ба (C)-дэхи панель гансал ERES (магент) [Gas1-GFP (саарал) ба Mid2-iRFP (хүхэ)]-да байһан бараа харуулхын тулада болбосоруулһан зурагуудые харуулна. (C) Сагаан дүүргэгдэһэн сумаа: ERES, бараанай дабхарлалта. Нээмэл һумаар: ERES гансахан зүйлые агуулна. Доодо панел: Шэлэгдэhэн ERES (C)-дэ тэмдэглэгдэһэн дабхар бараануудтай (1 ба 2). Хэмжээнэй зурлаа, 100 нм. (D) (C)-дэ тодорхойлһон фотомикрографын тоосоолол. sec31-1 ба sec31-1 GhLag1 нэгэдэлнүүдтэ гансал нэгэ ашаа (Gas1-GFP гү, али Mid2-iRFP) оруулагдаһан, тусгаарлагдаһан ашаа ба дабхарлаһан ашаанай ERES-эй дунда зэргын хуби. Гурбан бэеэ дааһан туршалгануудта 54 эстэ n = 432 (sec31-1) ба 47 эстэ n = 430 (sec31-1 GhLag1). Алдуугай зурлаа = SD. Хоёр һүүлтэй хосгүй t тест. *** P = 0.0002 (сек31-1) ба ** P = 0.0031 (сек31-1 GhLag1). (E) (C)-дэ тэмдэглэгдэһэн дабхарлаһан ашаатай (3) шэлэгдэhэн ERES-эй 3D зураг. Gas1-GFP (ногоон) ба Mid2-iRFP (хүхэ) ERES (магент) нэгэ талаһаа дүтэлжэ, нэгэ ERES хизаарлагдамал газарта үлэнэ. Хэмжээнэй зурлаа, 100 нм.
Энэ шэнжэлэлгэ липид дээрэ һуурилһан уураг ашаа шүүрэлэй замда шэлэн экспортын газарнуудта ангилагдадаг тухай шууд in vivo баримта үгэжэ, ангилалгын шэлэн абаха шадабарида ацил гинжын утанай шухала үүргые элирүүлнэ. SCLIM гэжэ нэрэтэй хүшэрхэг ба дээдэ шатын микроскопиин арга хэрэглэн, бидэ шэнээр синтезлэгдэһэн Gas1-GFP (гол плазмын мембран GPI-AP, ехэ ута ацил гинжэтэй (C26) керамид липидэй хэһэг) мёд соо харуулаабди) Дискретнэ ER-нүүдтэ бүлэглэгдэһэн бүһэ нютагууд тусхай ERE-тэй холбоотой, харин трансмембранна уурагууд ERRES-ээр дамжан тараагдана (Зураг 1). Нэмэжэ хэлэхэдэ, эдэ хоёр янзын бараа ондо ондоо ERES-дэ шэлэн ородог (Зураг 2). Мембран соохи эсэй керамидай ацил гинжын ута C26-һаа C18-C16 хүрэтэр багадхадаг, Gas1-GFP кластер дискрет ER бүһэдэ таһардаг, Gas1-GFP тэрэл ERES-ээр дамжуулан трансмембранна уурагтай ER-һээ гарахын тулада һэлгэгдэдэг (Зураг 3 ба Зураг 3). 4).
GPI-AP ER-һээ гарахын тулада тусхай уураг механизм хэрэглэдэгшье һаа, C26 керамидһаа дулдыдаха тусгаарлалта ERES-эй мэргэжэлжүүлгэдэ хүргэхэ дифференциальна уураг харилсан үйлэшэлэлгэ дээрэ тулгуурилдаггүй гэжэ бидэ олообди (Зурагууд S4 ба S5). Харин манай ололтонь липид дээрэ һуурилһан уурагуудай кластеризаци болон бусад ашаануудые хаһахаһаа үүдэһэн өөр ангилалгын механизмые дэмжэнэ. Манай ажаглалтанууд тодорхой ERES-тэй холбоотой Gas1-GFP бүһэ нютаг гү, али кластерта трансмембран шүүрэлтэтэй Mid2-iRFP уураг үгы гэжэ харуулна, энэнь C26 керамидһаа дулдыдаха GPI-AP кластер тэдэнэй холбоотой ERES-дэ орохо арга боломжые хялбаршуулха, тиихэдэ трансмембран шүүрэлые хаһаха гэжэ харуулна. Харин ER мембранада C18-C16 керамидуудай байрлалга GPI-AP-ые бүһэ нютагуудые гү, али кластернуудые бии болгодоггүй, тиимэһээ тэдэ трансмембран шүүрэлтэтэй уурагуудые нэгэ ERES-дэ оруулдаггүй гү, али һэлгэдэггүй (Зураг 3 ба 4). . Тиимэһээ бидэ C26 керамид тусхай ERES-тэй холбоотой уурагуудай кластеризациие хялбаршуулха замаар тусгаарлалта ба ангилалые хүтэлбэрилдэг гэжэ дурадханабди.
Энэ С26 керамидһаа дулдыдаха кластеризациие тодорхой ER бүһэдэ яажа бэелүүлхэб? Мембран керамидай хажуу тээшээ тусгаарлаха хандалга GPI-AP ба C26 керамидые богони ба ханаагүй глицеролипидүүдые агуулһан ER мембранай илүү тогтомол бэшэ липидэй оршон соо багахан ба агшин зуурын гуримтай липидүүдые бии болгожо магадгүй. Шанарай кластернууд (17, 18). Эдэ багахан саг зуурын кластернууд p24 комплекстэй холбогдоһоной һүүлдэ томо, тогтууритай кластернууд боложо ниилэжэ болоно (34). Энээнтэй тааруулан, бидэ C26 Gas1-GFP p24 комплекстой харилсан үйлэшэлжэ, томо харагдаха кластернуудые бии болгохо хэрэгтэй гэжэ харуулаабди (Зураг 3). p24 комплекс хадаа мёд соохи дүрбэн ондо ондоо p24 трансмембранна уурагһаа бүридэһэн гетерозигот олигомер юм (35), энэнь олон үнэтэй холбоо хангадаг, энэнь бага GPI-AP кластернуудай холбооһондо хүргэжэ, тиигэжэ томо тогтосотой кластер бии болгодог (34). GPI-AP-эй уураг эктодоменүүдэй хоорондохи харилсан үйлэшэлэлгэ тэдэнэй агрегацида баһал хубита оруулдаг, энэнь һүн тэжээлтэнэй поляризацилагдаһан эпителийн эсүүдтэ Гольджиин дамжуулгын үедэ харуулагдана (36). Гэбэшье, ER мембранада C18-C16 керамид байхада, p24 комплекс Gas1-GFP-тэй холбогдоходоо, томо тусгаар кластернууд бии болохогүй. Үндэһэн механизм ута ацил гинжын керамидай тусхай физикын ба химиин шанарһаа дулдыдажа магадгүй. Хиймэл мембрануудай биофизикын шэнжэлэлнүүд ута (C24) ба богони (C18-C16) ацил гинжэтэ керамидууд хоюулаа фазын илгарал үүсхэжэ шададагшье һаа, гансал ута ацил гинжэтэ керамидууд (C24) үндэр муруйлал ба плёнкын нугалбариие дэмжэжэ, плёнкое шэнэлхэ аргатай гэжэ харуулна. Харилсан холбоогоор (17, 37, 38). Emp24-эй хүнэй гомолог болохо TMED2-эй трансмембранна спираль цитоплазмын лобулянуудта C18 керамид дээрэ һуурилһан сфингомиелинтэй шэлэн харилсан үйлэшэлдэг гэжэ элирүүлэгдэһэн байна (39). Молекулярна динамикын (MD) дууряалга хэрэглэн, бидэ C18 ба C26 керамидууд хоюулаа Emp24 трансмембранна спираль цитоплазмын лобулянуудые тойрон суглардаг гэжэ олообди, тиигээд тэдэ адли дуратай байдаг (Зураг S6). Энэнь Emp24-эй трансмембранна спираль мембранада липидэй тэгшэ бэшэ хубаарида хүргэжэ болохо гэжэ харуулна гэжэ тэмдэглэхэ шухала. Энэ хадаа һүн тэжээлтэнэй эсүүд дээрэ үндэһэлһэн һаяын дүнгүүд юм. Үшөө тиимэ MD дууряалганууд эфирэй липидүүдэй бии байһые харуулна (40) . Тиимэһээ ER26-ай хоёр лобуля соохи C26 керамид нютагтаа баяжуулагдаһан гэжэ бидэ таамаглажа байнабди. Гэрэлтэ лобулын GPI-AP олон үнэтэ p24-тэй шууд холбогдожо, цитоплазмын лобулын p24-ые тойроод C26 керамидай хуримталалые дэмжэжэ болохо, энэнь уураг агрегаци болон мембранай муруйе хургаараа үүсхэдэг (41), энэнь GPI-AP-ые ERES-тэй зэргэлээд байһан тусгаар бүһэ нютагуудта хубааха боломжо олгодог, энэнь баһал үндэр муруйтай бүһэ нютагуудые дэмжэдэг ER мембрана (42). Урданай мэдээсэлнүүд дурадхагдаһан механизмые дэмжэһэн байна (43, 44). Олиголектин, эмгэг үүсхэгшэ гү, али эсрэгбиенүүдэй плазмын мембрана дээрэхи керамид дээрэ һуурилһан гликосфинголипидүүдтэй (GSL) олон үнэтэй холбоо тогтоохо нь GSL-эй томо агрегациие үүсхэжэ, фазын илгаралые нэмэгдүүлжэ, мембранай деформаци болон дотоодшолго үүсхэнэ (44). Ивабучи гэхэ мэтэ (43) Ута (C24) харин богони бэшэ (C16) ацил гинжын байхада GSL лактозилцерамидтай холбоотой олон үнэтэ лиганд томо кластернуудые бии болгожо, мембранада нэбтэрэлгэ үүсхэжэ, цитоплазмын Lyn-зууршалһан дохёо дамжуулга листовконууд дээрэ нейтрофил хосуудаар дамжуулагдадаг гэжэ элирүүлэгдэһэн байна.
Хөхөөр хооллодог амитадай поляризацилагдаһан эпителийн эсүүдтэ анти-Гольджиин сүлжээнэй (TGN) концентраци апикальна плазмын мембранай хэмжээндэ GPI-AP-эй илгарал ба ангилалые ударидадаг (10, 45). Энэ агрегаци GPI-AP олигомеризациар (36) хүтэлбэрилэгдэдэг, харин энэнь дрожжи соо олоһон керамид гинжын утаһаа дулдыдажа магадгүй. Хэдыгээр һүн тэжээлтэнэй GPI-AP эфирэй липид дээрэ һуурилһан зангуутай, химиин бүтэсэнь тон ута ацил гинжын керамидһаа тон илгаатайшье һаа, һаяын шэнжэлэлгын дүнгөөр ​​хоер липидүүд хубисхалай үүдэнһээ адлирхуу физикын ба химиин шэнжэ шанартай ба үйлэ ажаллалгатай гэжэ элирүүлһэн байна (40). Тиимэһээ һүн тэжээлтэнэй эсэй эфирэй липидэй хубинь мёд соохи С26 керамидтай адли байжа болохо ба тэрэнэй үүргэ хадаа GPI-AP-эй агрегаци болон илгаралые дэмжэхэ мембран соохи ута гинжэтэ керамидтай холбоотой байха юм. Энэ боломжые шууд туршаха хэрэгтэйшье һаа, урданай ололтонь ута ацил гинжын керамидые Гольджиин бэе руу дамжуулха үйлэ ажаллалгые цитоплазмын дамжуулха уурагуудаар ябуулдаггүй, харин мёд мэтэ GPI зангилаануудай синтезһээ дулдыдаха гэжэ баталан харуулна. Тиимэһээ хубисхалай консерватив механизм нэгэ тээбэриин везикул соо тон ута ацил гинжэтэ керамид ба GPI-AP (13, 16, 20, 46, 47) шэлэн хамта дамжуулха аргатай мэтээр харагдана.
Мөөгөнцөр болон һүн тэжээлтэнэй поляризацилагдаһан эпителийн эсэй системэдэ GPI-AP-эй агрегаци болон бусад плазмын мембранай уурагуудһаа тусгаарлалта эсэй гадаргуу хүрэхэһөө урид болодог. Паладино болон бусад (48) һүн тэжээлтэнэй поляризацилагдаһан эпителиин эсэй TGN дээрэ GPI-AP-эй кластеризаци ганса GPI-AP-ые апикальна плазмын мембранада шэлэн ангилхада хэрэгтэй бэшэ, харин GPI-AP-эй кластеризациин эмхидхэл болон тэрэнэй биологическа үйлэ ажаллалгые зохисуулдаг гэжэ элирүүлһэн байна. Эсэй гадаргуу. Мөөгөнцөртэ энэ шэнжэлэлгын дүнгөөр ​​ER дээрэхи C26 керамидһаа дулдыдаха GPI-AP кластер плазмын мембрана дээрэхи GPI-AP-эй кластерай эмхидхэл ба функциональна үйлэ ажаллалгые зохисуулха аргатай (24, 49). Энэ загбарта тааруулан, GhLag1 эсүүд GPI дарангуйлагшадта гү, али эсэй ханануудай бүтэн байдалда нүлөөлдэг эмүүдтэ харшилтай байдаг (28), тиигээд мёдной эсүүдэй ниилэлтэдэ түсэблэгдэһэн үзүүрэй керамидай үйлэ ажаллалгын Gas1-GFP кластернуудай (49) хэрэгсэл hLag1 эсүүдэй боломжотой физиологическа үрэ дүн G харуулна. GPI-AP алдуу. Гэбэшье, эсэй гадаргуугай функциональна эмхидхэл липидэй ута дээрэ үндэһэлһэн сортын аргаар ER-һээ программировалагдаһан гү гэжэ саашадаа туршаха гээшэ манай ерээдүйн шэнжэлэлгын сэдэб болохо.
Энэ ажалда хэрэглэгдэһэн Saccharomyces cerevisiae штаммууд S1 таблицада үгтэнэ. Амида эсэй дүрсэлэлгын SCLIM-эй MMY1583 ба MMY1635 штаммуудые W303-ай үндэһэн дээрэ бүтээһэн байна. Sec13-mCherry-ые флуоресцентнэ уураг тэмдэгтэй илгаруулдаг эдэ штаммуудые pFA6a плазмида загбар болгон полимераза гинжэтэ харюу (PCR)-дэ үндэһэлһэн аргаар бүтээһэн байна (23). GAL1 промоторой ударидалга доро флуоресцентнэ уурагтай Mid2-iRFP илгаруулдаг штамм иимэ аргаар бүтээгдэһэн байна. pKTiRFP-KAN векторһоо iRFP-KanMx дараалалые ПЦР-ээр олшоруулха (E. O'Shea-гай бэлэг, Addgene плазмид дугаар 64687; http://n2t.net/addgene: 64687; шэнжэлэлгын нөөсын идентификатор (RRID): Addgene_64687) ба C22-ой эндогенэй һүүлшын хэһэгтэ оруулагдаһан. Mid2-iRFP геномой дараалалые олшоруулжа, GAL1 промоторто клонировалһанай һүүлдэ, энэнь pRS306 интеграциин плазмида Not I-Sac I газарта нэбтэрүүлэгдэһэн байна. Үүсэһэн pRGS7 плазмидые Pst I-тэй шугаман болгожо URA3 локус руу нэбтэрүүлһэн байна.
Gas1-GFP синтезэй ген центромер (CEN) плазмида GAL1 промоторой ударидалга доро илгаруулагдадаг, энэнь иимэ бүтэсэтэй. Gas1-GFP дараалалые pRS416-GAS1-GFP плазмидаһаа (24) (L. Popolo-гай бэлэг) ПЦР-ээр олшоруулжа, CEN плазмида pBEVY-GL LEU2-эй Xma I–Xho I газарта (C-эй бэлэг) клонировалһан байна. Миллер; Адгенэй плазмид 51225 дугаартай; http://n2t.net/addgene: 51225; RRID: Addgene_51225). Үүсэһэн плазмидые pRGS6 гэжэ нэрлэбэ. Axl2-GFP синтезэй ген pBEVY-GL LEU2 векторой GAL1 промоторой ударидалга доро баһа илгаруулагдадаг ба тэрэнэй бүтэсэ иимэ байна. Axl2-GFP дараалалые pRS304-p2HSE-Axl2-GFP плазмидаһаа (23) ПЦР-ээр олшоруулжа, pBEVY-GL LEU2 векторой Bam HI-Pst I газарта клонировалһан байна. Үүсэһэн плазмидые pRGS12 гэжэ нэрлэбэ. Энэ шэнжэлэлгын үедэ хэрэглэгдэһэн олигонуклеотидуудай дараалал S2 таблицада үгтэнэ.
Штамм 0.2% аденин ба 2% глюкоза [YP-декстроза (YPD)], 2% рафиноз [YP-рафиноз] баялиг мёд экстрактын уураг p (YP) оршон (1 % мёд экстракт ба 2% уураг ept) нэмэгдэһэн байна. (YPR)] гү, али 2% галактоза [YP-галактоза (YPG)] нүүрһэнтүрэгшын эхи үүсэбэри болгон, али синтетическэ минималист оршондо (0.15% мёдной азотой һуури ба 0.5% аммониин сульфат) хоол тэжээлдэ хэрэгтэй зохистой аминохүшэл ба һууриие нэмэлтэ болгон хэрэглэхэ, ба 2% глюкоза (2% глюкоза) гү, али минимум глюкоза агуулһан нүүрһэнтүрэгшын эхи үүсэбэри болгон галактоза (синтетическэ галактозын эгээн бага оршон).
Бодото сагта дүрсэлэлгын тулада GAL1 промотор доро бүтэсэ илгаруулдаг температурада мэдрэмтгий sec31-1 мутант эсүүдые YPR оршондо 24°C-та һүниин туршада дунда лог үе хүрэтэр ургуулһан байна. YPG-дэ 24°C-та 1 часай туршада индукци хэһэнэй удаа эсүүдые 37°C-та SG-дэ 30 минутын туршада инкубаци хэжэ, удаань 24°C-та шэлжүүлжэ, секрециин блокһоо гаргаба. Конканавалин А-ые шэл слайд дээрэ эсүүдые заһаха хэрэгсэл болгон хэрэглэжэ, SCLIM-ээр зураглаһан байна. SCLIM хадаа Olympus IX-71 урбуулһан флюоресценциин микроскоп ба UPlanSApo 100×1.4 тоогой диафрагматай тоһоной линзэ (Olympus), үндэр хурдатай ба үндэр дохио-шууяан харисаатай эргэдэг дискэй конфокальна сканер (Yokogawa Electric), тусхай спектрометр, эршэмтэй болгогшо системын хослол юм (Hamamatsu Photonics) ×266.7 һүүлшын томошуулгатай томошуулха линзын системэ ба электронуудые үржүүлдэг зарядтай холбоотой түхеэрэмжын камера (Hamamatsu Photonics) үгэжэ шадаха (21). Зураг абалга тусхай программна хангамжаар (Yokogawa Electric) хэгдэдэг. 3D зурагуудта бидэ объективэй линзэ босоогоор хүдэлгэхэ захиалгаар бүтээгдэһэн пьезоэлектрическэ хүдэлгүүр хэрэглэжэ, оптикын хэһэгүүдые 100 нм зайтайгаар дэбтэр соо суглуулаабди. Z-stack дүрсэ 3D воксель мэдээсэл болгон хубилгагдадаг ба эргэдэг дискын конфокальна микроскопто хэрэглэгдэдэг онол точкын тархалта функци Volocity программын (PerkinElmer) ашаар деконволюциин болбосоруулгада хэрэглэгдэдэг. Volocity программын ашаар хамтын байрлалга шэнжэлэлгын автоматаар босоо хэмжээе хэмжэжэ, ERES-ые ашаае багтааһан хэмжэжэ үзэбэ. Шугамай сканерэй шэнжэлэл MetaMorph программын (Molecular Devices) ашаар хэгдэһэн байна.
Статистикын удха шанарые тодорхойлхын тулада GraphPad Prism программые хэрэглэхэ. Хоёр һүүлтэй Студентын t-тест болон дисперсиин юрын нэгэ тээшээ шэнжэлэлгын (ANOVA) тестын түлөө бүлэгүүдэй хоорондохи илгаанууд P <0.05 (*)-да нүлөө үзүүлдэг гэжэ үзэдэг.
Gas1-GFP-эй флуоресценциин микроскопиин түлөө лог-фазын эсүүдые YPD-дэ һүниин туршада ургуулжа, центрифугировалжа суглуулжа, фосфат буфертэй дабһатай уһаар хоёр дахин угаагаад, 15 минутаһаа багагүй хугасаагаар мүльһэн дээрэ инкубаци хэжэ, уридшалан тодорхойлһон ёһоор микроскоп доро үргэлжэлүүлһэн байна. Шалгаха (24). Объектив линзэтэй, L5 (GFP) шүүгшэтэй, Хамаматсу камератай, Application Suite X (LAS X) программна хангамжатай Leica DMi8 микроскоп (HCX PL APO 1003/1.40 oil PH3 CS) абаһан байна. .
Дээжые 65°C-та 10 минутын туршада SDS дээжын буферээр денатурировалһан, удаань SDS-полиакриламид гель электрофорезээр (PAGE) тусгаарлаһан. Иммуноблот шэнжэлэлгын тулада 10 мкл дээжые зурлаа бүхэндэ ашаглаһан байна. Юрэнхы эсэргүү бодос: туулай поликлональна анти-Gas1 1:3000 шэнгэн, туулай поликлон анти-Emp24 1:500 шэнгэн, туулай поликлон анти-GFP (H. Riezman-ай бэлэг) 1:3000 шэнгэн хэрэглэхэ. Хулгана моноклональна анти-Pgk1 эсэргүү бодосые 1:5000 шэнгэнээр хэрэглэбэ (J. de la Cruz-ай бэлэг). Хоёрдохи эсэргүү бодос: Хренэй пероксидаза (HRP) 1:3000 (Пирс) шэлжүүлһэн ямаанай анти-туулай иммуноглобулин G (IgG) конъюгированна. HRP-конъюгированна ямаанай анти-хулгана IgG 1:3000 (Пирс) шэлжүүлгэтэйгээр хэрэглэбэ. Дархалалай харюугай бүһэ SuperSignal West Pico реагентын (Thermo Fisher Scientific) химилюминесценциин аргаар ажаглагдаа.
(31)-дэ тодорхойлһон ёһоор, баяжуулһан ER фракци дээрэ байгаалиин иммунопреципитациин туршалга хэгдэһэн байна. Тобшохоноор хэлэбэл, мёдной эсые TNE буферээр [50 мМ трис-HCl (рН 7.5), 150 мМ NaCl, 5 мМ EDTA, 1 мМ фенилметилсульфонилфторид ба протеаза дарангылагша холисо) 600 нм (OD600) 100 оптикын нягта хоёр дахин угааха. Тэрэниие шэл шүрэнүүдээр таһалжа, удаань эсэй хог хаягдал ба шэл шүрэнүүдые центрифугировалжа зайлуулһан байна. Удаань дээдын шүүһые 17,000 г-да 15 минутын туршада 4°C-та центрифугировалһан байна. Гранулые TNE-дэ дахин суспендироваад, 1%-иин һүүлшын концентрацида дигиталис сапонин нэмэбэ. Суспензиие 4°C-та эрьюулжэ 1 часай туршада инкубаци хэжэ, удаань уһалдаггүй бүридүүлэгшэ хэһэгүүдые 13,000 г-да 4°C-та 60 минутын туршада центрифугировалжа зайлуулһан байна. Gas1-GFP иммунопреципитацида түрүүн дээжые хооһон агарозын шүрэнүүдээр (ChromoTek) 4°C-та 1 часай туршада уридшалан инкубаци хэхэ, удаань GFP-Trap_A (ChromoTek)-тай 4°C-та 3 часай туршада инкубаци хэхэ. Иммунопреципитированна шүрэнүүдые 0.2% дигоксигенин агуулһан TNE-ээр таба дахин угаагаад, SDS дээжын буферээр элюировалжа, SDS-PAGE дээрэ тусгаарлажа, иммуноблоттингоор шэнжэлһэн байна.
(31)-дэ тодорхойлһон ёһоор, баяжуулһан ER фракци дээрэ холбооһоной тодорхойлолто хэгдэһэн байна. Тобшохоноор хэлэбэл, баяжуулһан ER фракциие 0.5 мМ дитиобис (сукцинимидил пропионат) (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA; 20°C, 20 мин)-тай инкубаци хэбэ. Глицин нэмэжэ (50 мМ һүүлшын концентраци, 5 минута, 20°C) һэлбүүлгын урбалые унтараа.
Урдань тодорхойлһон ёһоор (50), зэрлиг түхэлэй ба GhLag1 штаммуудта керамидай MS шэнжэлэл хэгдэһэн байна. Тобшохоноор хэлэбэл, эсүүдые 30°C-та YPD-дэ экспоненциальна үе хүрэтэр (3-һаа 4 OD600 нэгэдэл/мл) ургуулжа, 25×107 эсүүдые хуряажа абаһан байна. Тэдэнэй бодосой солилсоо трихлоруксусай хүшэлтүрэгшээр унтараагдадаг. Экстракциин уһалагша [этанол, уһан, эфир, пиридин ба 4.2 Н аммониин гидроксид (15:15:5:1:0.018 v/v)] ба 1.2 нмоль дотоодо стандарт C17 керамид (860517, Avanti полярна липид) шанар хэрэглэхэ). Экстрактын бага зэргын шүлтлэг гидролиз хэхэдээ монометиламин реагент [метанол, уһан, н-бутанол ба метиламин урасхал (4:3:1:5 v/v)] хэрэглэжэ, удаань уһаар ханаһан н-бутанол хэрэглэн дабһа арилгаха. Һүүлдэнь экстрактые эерэг горимоной уһалдаг бодосдо [хлороформ/метанол/уһан (2:7:1) + 5 мМ аммониин ацетат] дахин суспендироваад, масс-спектрометртэ таряа. Сфинголипидэй молекулануудые элирүүлхэ ба тодорхойлхын тулада олон харюугай мониторинг (MRM) хэгдэһэн байна. TSQ Vantage гурбадахи квадруполь масс-спектрометр (Thermo Fisher Scientific) липид шэнжэлэлгын робот нанофруслай ионой эхи һэн Nanomate HD (Advion Biosciences, Ithaca, NY)-ээр тоноглогдоһон байна. Мүргэлдөөнэй энергинь керамидай ангилал бүхэндэ оностой болгогдоһон байна. MS мэдээсэл эерэг горимоор абтаһан байна. Биологиин дабталга бүхэндэ липидэй дохёо гурбан бэе дааһан хэмжүүрэй дунда зэргые харуулна.
(31)-дэ тодорхойлһон ёһоор, Gas1-GFP илгаруулдаг эсүүдые (800×107) байгаалиин иммунопреципитацида оруулһан байна. Сэбэрлэгдэһэн Gas1-GFP-ые SDS-PAGE-ээр тусгаарлажа, поливинилиденфторид (PVDF) мембранада дамжуулһан байна. Уурагые PVDF-ые амид хара үнгөөр ​​будажа харуулһан байна. Gas1-GFP бүһэ PVDF-һээ таһалагдажа, 5 дахин метанолоор, нэгэ дахин шэнгэн хроматографиин-MS (LC-MS) уһаар угаагдаа. Мембранна зурлаа 500μl 0.3 М NaOAc (рН 4.0), буфер ба 500μl шэнэхэн уһанда шэнгээһэн 1 М натрийн нитрит холисотой 37°C-та 3 часай туршада инкубаци хэхэдээ, липидэй фракци Gas1-GFP-һээ гаража, глюкозамин ба глюкозамин хоорондын лизисэй инкубаци болоно (51). Тэрэнэй һүүлдэ мембранна зурлаа LC-MS сортын уһаар дүрбэн дахин угаагаад, танхимайнгаа температурада хатаажа, шэнжэлэл хэхэ болотор -80°C-та азотой агаар мандалда хадагалһан байна. Хяналтын зорилгоор туршалга бүхэндэ PVDF мембранай хооһон дээжые хэрэглэбэ. Gas1-GFP-һээ абтаһан липидые MS-ээр шэнжэлһэн байна (50). Тобшохоноор хэлэбэл, GPI-липид агуулһан PVDF зурлаануудые 75μl сүлөөтэ хэбтэшэ уһалагшада [хлороформ/метанол (1:2) + 5 мМ аммиак ацетат] дахин суспендироваад, электроспрей ионизаци (ESI)-MRM/MS сфинголипид зүйлнүүдэй шэнжэлэл (TSQ Vantage) үнгэргөө. Энэ ушарта MS мэдээсэлые сүлөөтэ ионой горимоор абаһан байна.
Урдань хэлэгдэһэнэй ёһоор, GPI зангилаанай липидэй хуби [3H]-инозитол тэмдэгтэй GPI-AP-һээ тусгаарлагдаһан байна (16). Липидүүдые уһалдаг системэ (55:45:10 хлороформ-метанол-0.25% KCl) хэрэглэн нимгэн дабхаргын хроматографиин аргаар тусгаарлажа, FLA-7000 (Fujifilm) хэрэглэн үзүүлһэн байна.
Gas1-GFP (600×107) илгаруулдаг эсүүдые TNE буфертэй TNE буферээр хоёр дахин угаагаад, шэл шүрэнүүдээр таһалжа, эсэй хог хаягдал ба шэл шүрэнүүдые зайлаха зорилгоор центрифугировалһан байна. Удаань дээдын шүүһые 17,000 г-ээр 1 часай туршада 4°C-та центрифугировалһан байна. Гранулые TNE-дэ угаагаад, 0.2% digitalis saponin агуулһан TNE-дэ 1 U PI-PLC (Invitrogen)-тай 37°C-та 1 часай туршада инкубаци хэбэ. Ферментээр эмшэлһэн һүүлдэ мембраные 17,000 г-да 4°C-та 1 часай туршада центрифугировалжа зайлуулһан байна. Gas1-GFP-ые иммунопреципитаци хэхэдээ, супернатант GFP-Trap_A (ChromoTek)-тай 4°C-та һүниин туршада инкубацилагдаһан байна. SDS-PAGE-ээр тусгаарлагдаһан сэбэрлэгдэһэн Gas1-GFP-ые Coomassie гэрэлтэ хүхэ үнгөөр ​​будажа абаһан байна. Gas1-GFP будаха бүһэ уһанай дамжуулгын тойроод байһан сааралһаа таһаржа, удаань йодацетамидаар алкилировалжа, дитиотреитолтой редукциин һүүлдэ трипсинээр гель доторхи шэнжэлэлгэ хэгдээ. GPI-гликануудтай триптик пептидүүдые ба пептидүүдые гаргажа хатааха. Хатаагдаһан пептидые 20 мкл уһанда уһалһан байна. ЖК-да нэгэ хуби (8μl) оруулха. Октадецилсилан (ODS) колонко (Develosil 300ODS-HG-5; дотоодо диаметр 150 мм×1.0 мм; Nomura Chemical, Aichi Prefecture, Japan) тусхай градиент нөхцөлд пептидүүдые тусгаарлахын тулада хэрэглэбэ. Хүдэлөөнэй үе шатань А (0.08% мэрээшэнэй хүшэлтүрэгшэ) ба В уһалагша (80% ацетонитрилдэ 0.15% мэрээшэнэй хүшэлтүрэгшэ) юм. Accela HPLC системэ (Thermo Fisher Scientific, Boston, Massachusetts) хэрэглэн, 55 минутын туршада 50 μl min-1 гүйдэлэй хурдаар 5 минутын туршада А уһалдаг бодосоор колонко элюулжэ, удаань уһалагшын В концентрациие 40% хүрэтэр нэмэгдүүлһэн байна. , АНУ). Элюат ESI ионой эхиндэ үргэлжэ оруулагдажа, триптик пептидүүд болон GPI-гликануудтай пептидүүдые LTQ Orbitrap XL (гибрид шугаман ион трап-орбитрап масс-спектрометр; Thermo Fisher Scientific)-ээр шэнжэлһэн байна. МС-эй тохиргоодо капиллярай эхинэй хүшэлтүрэгшэ 4.5 кВ болгожо, дамжуулха капиллярай температура 300°C-та байлгаһан байна. Капилляр хүшэлтүрэгшэ ба гуурһанай линзын хүшэлтүрэгшэ тус тусдаа 15 В ба 50 В гэжэ тохируулагдаһан байна. MS мэдээсэлые 300/m/z масса/зарядай харисаа (m/z) 3000 массын диапазондо эерэг ионой горимоор (60,000 нягтабари; саяда 10 хэһэгэй массай үнэн зүб) абаһан байна. MS/MS мэдээсэлые LTQ орбитын ионой урьһаламжаар абаһан байна [XL, XL дансанууд, энэнь түрүүшын тооһоо дулдыдана мүргэлдөөнэй үүсхэһэн диссоциаци (CID)].
MD-моделировани GROMACS (52) программна хангамжа болон MARTINI 2 хүсэнэй талмай (53-55) хэрэглэн хэгдэһэн байна. CHARMM GUI Membrane Builder (56, 57) диолеоилфосфатидилхолин (DOPC) ба Cer C18 гү, али DOPC ба Cer C26 агуулһан хоёр дабхаргые бүтээхэдээ хэрэглэгдээ. Cer C26-ай топологи ба координатануудые DXCE-һээ сфингозинай һүүлһээ нэмэлтэ шүрэнүүдые зайлуулжа абаһан байна. Дооро тайлбарилагдаһан үйлэ ябасые хэрэглэн хоёр дабхарые тэнсүүлжэ, тэрэнээ ашаглажа, удаань системын һүүлшын координатануудые хэрэглэн Emp24 агуулһан системэ байгуулха. Emp24 мёдной трансмембранна домен (173-һаа 193 хүрэтэр үлэгдэлнүүд) α-спираль болгон үзэгдэлтэ MD (VMD) хэрэгсэлэй молекулярна бүтэсэ (58) хэрэглэн бүтээгдэһэн байна. Удаань, дабхарлаһан липидүүдые зайлуулһанай удаа, уурагые бүдүүн грануляци хэжэ, CHARMM GUI хэрэглэн хоёр дабхарта оруулһан байна. Һүүлшын системэдэ 1202 DOPC ба 302 Cer C26 гү, али 1197 DOPC ба 295 Cer C18 ба Emp24 ороно. Системые 0.150 М концентрацида ионизацилха. Хоёр дабхар бүридэлдэ дүрбэн бэеэ дааһан дабталга хэгдээ.
Липидэй хоёр дабхаргые CHARMM GUI үйлэ ябасаар тэнсүүлнэ, энэнь 405,000 алхамуудые бага болгожо, удаань тэнсүүлнэ, эндэ байра һууриин хизаарлалтануудые аажамаар багадхажа, усадхадаг, тиигээд сагай алхамые 0.005 ps-һээ 0.02 ps хүрэтэр нэмэгдүүлдэг. Тэнсүүлгын һүүлдэ 0.02 ps сагай алхамтай 6 μs гаргадаг. Emp24 оруулһанай һүүлдэ, системые бага болгожо, тэнсүүлхын тулада CHARMM GUI-н адли үйлэ ябасые хэрэглэжэ, удаань үйлэдбэрилэлдэ 8 с хүдэлхэ.
Бүхы системэдэ тэнсүүрилхэ үйлэ ябасада даралтые Берендсенэй баростат (59) ударидадаг, үйлэдбэрилэлэй үедэ даралтые Парринелло-Рахманай баростат (60) ударидадаг. Бүхы ушарта дунда зэргын даралтань 1 бар болоод хахад изотроп даралтын холболтын схемые хэрэглэнэ. Тэнсүүри ба үйлэдбэрилэлэй үйлэ ябасада уураг, липид ба уһалагшын хэһэгүүдэй температура тус тус холбохын тулада хурданай дахин шалгалтатай термостат (61) хэрэглэгдэдэг. Бүхы ажаллалгын үедэ зорилтот температура 310K болоно. Холбоогүй харилсан үйлэшэлэлгэ 0.005 буферэй тэсэбэритэй Верле схемые хэрэглэн хослуулан жагсаалтые бии болгожо тоосоно. Кулоной нэрэ томьёое реакциин талмай болон 1.1 нм-эй таһалбариин зайе хэрэглэн тоосоно. Вандер Ваалсын нэрэ томьёо 1.1 нм-эй таһалбариин зайтай таһалбариин схемые хэрэглэнэ, харин Верлетын таһалбариин схемые боломжотой дрейфтэ хэрэглэнэ (62).
VMD хэрэглэн, DOPC фосфат шүрэ гү, али керамид AM1 шүрэ ба уураг хоорондын долгиной ута 0.7 нм болоод уурагтай харилсан үйлэшэлдэг липидэй тоо тоосогдодог. Удаадахи томьёогоор (63)-дахи мэтэ хосорол-баяжуулгын (DE) коэффициентые тоолохо: DE коэффициент = (уураг соохи ниитэ липидэй хэмжээ 0.7) уураг 0.7 соо (ниитэ липидэй Cer-эй хэмжээ)
Мэдээсэгдэһэн сэн дунда зэргээр абтадаг ба алдуугай зурлаанууд SE-гэй дүрбэн бэеэ дааһан хуулбари болоно. DE факторой статистикын удха шанар t тестээр [(averageDE-factor-1)/SE] тоосогдодог. Нэгэ һүүлтэй хубаариһаа Р сэн тоолохо.
GROMACS хэрэгсэл мүрэй һүүлшын 250 нс дотор Emp24 агуулһан системын 2D хажуугай нягта карта тоосоолходо хэрэглэгдээ. Керамидай баяжуулгын/хосоролой карта абахын тулада Cer-эй нягта карта Cer ба DOPC-эй картануудай суглуулбарида хубаагдажа, удаань бэеын Cer-эй концентрацида хубаагдана. Нэгэ үнгын картын хэмжүүр хэрэглэгдэдэг.
Энэ үгүүлэлэй нэмэлтэ материалнуудые http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/50/eaba8237/DC1 харагты
Энэ хадаа Creative Commons Attribution-Non-Commercial License-эй ёһоор тараагдаһан нээлтэтэ нэбтэрхэй толи болоод энэнь ямаршье хэрэгсэлээр хэрэглэхэ, тарааха, хубилгаха боломжо олгодог, хэрбээ һүүлшын хэрэглэлгэ олзын хэрэг эрхилэлгын түлөө бэшэ, анханай бүтээл зүб байха ёһотой. Дурдалга.
Анхарал: Хуудаһанда дурадхаһан хүнтнай энэ сахим бэшэгые харуулхыень хүсэжэ байһанаа, энэнь спам бэшэ гэжэ мэдэхын тулада бидэ гансал өөрынгөө сахим хаягые үгэхыетнай гуйнабди. Бидэ ямаршье сахим хаягуудые абахагүйбди.
Энэ асуудал таанадые айлшан гү гэжэ шалгаха ба автоматаар спам эльгээхэһээ сэргийлхэ хэрэгсэл болоно.
София Родригес-Галлардо, Казуо Курокава, Сюзанна Сабидо-Бозо, Алехандро Кортес · Гомес (Алехандро Кортес-Гомес), Ацуко Икеда (Ацуко Икеда), Валерия Зони (Валерия Зони), Ауксиадора Агилера-Ромеро, Ана Мария Перес -Линерхио Серхопе (Серхопе Лопе), (Михо Вага), Мисако Арман (Мисако Арман), Мияко Риман (Мияко Риман), Проу Акира, Стефано Фанни, Акихико Накано, Мануэль Мунис
3D үндэр нягтабаритай бодото сагта зураглал шэлэн гаралгын газарнуудта уураг илгаруулхада керамид гинжын утанай шухала үүргые элирүүлнэ.
София Родригес-Галлардо, Казуо Курокава, Сюзанна Сабидо-Бозо, Алехандро Кортес · Гомес (Алехандро Кортес-Гомес), Ацуко Икеда (Ацуко Икеда), Валерия Зони (Валерия Зони), Ауксиадора Агилера-Ромеро, Ана Мария Перес -Линерхио Серхопе (Серхопе Лопе), (Михо Вага), Мисако Арман (Мисако Арман), Мияко Риман (Мияко Риман), Проу Акира, Стефано Фанни, Акихико Накано, Мануэль Мунис
3D үндэр нягтабаритай бодото сагта зураглал шэлэн гаралгын газарнуудта уураг илгаруулхада керамид гинжын утанай шухала үүргые элирүүлнэ.
©2020 Эрдэм ухаанай хүгжэлэй Америкын холбоо. бүхы эрхэнүүд хамгаалагдаһан. AAAS хадаа HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef болон COUNTER-эй түншэ юм. Эрдэм ухаанай дэбжэлтэ ISSN 2375-2548.