Элэгэй фиброзтой үбшэнтэнэй гэдэһэ доторһоо гаралтай триптофанай метаболит индол-3-пропионой хүшэлтүрэгшын (IPA) һүнэй шүүһэнэй хэмжээн бага байдаг гэжэ бидэ урид мэдээсээ һэмди. Энэ шэнжэлэлгын үедэ бидэ таргалһан элэгэй транскриптом ба ДНХ-эй метиломые һүнэй IPA хэмжээнтэй холбоотойгоор шэнжэлээбди, мүн in vitro элэгэй одоной эсэй (HSCs) фенотипическэ эдэбхигүйжүүлгэдэ IPA-гай үүргэ шэнжэлээбди.
Энэ шэнжэлэлгэ 2-дохи түхэлэй сахарна диабетгүй (T2DM) 116 таргалһан үбшэнтэниие (46.8 ± 9.3 наһатай; BMI: 42.7 ± 5.0 кг/м2) Куопио бариатрическа хирургиин түбтэ (KOBS) бариатрическа операци хэһэн байна. Эргүүлжэ байһан IPA хэмжээе шэнгэн хроматографи-масс-спектрометриин (LC-MS) аргаар хэмжэжэ, элэгэй транскриптомой шэнжэлэлые ниитэ РНК-гай дараалалаар хэһэн, ДНХ-эй метилированиин шэнжэлэлые Infinium HumanMethylation450 BeadChip хэрэглэн хэгдэһэн байна. Хүнэй элэгэй одото эсүүдые (LX-2) in vitro туршалгануудта хэрэглэбэ.
Сийвэнгэй IPA хэмжээн элэгэй апоптоз, митофаг, ута наһанай замда хабаатай генүүдэй илгаралтай холбоотой. AKT серин/треонин киназа 1 (AKT1) ген элэгэй транскрипт болон ДНХ-эй метилированиин профильда эгээн элбэг ба ноёрхолтой харилсан үйлэшэлдэг ген байгаа. IPA эмшэлгэ апоптоз үүсхэжэ, митохондриин амилалга бууруулжа, LX-2 эсэй фиброз, апоптоз, амидаралые зохисуулдаг генүүдэй илгаралые хубилгаһанаар эсэй морфологи болон митохондриин динамикые хубилгаа.
Хамтадаа абахада, эдэ мэдээнүүд IPA-гай боломжотой эмнэлгын нүлөөтэй, апоптоз үүсхэжэ, HSC-эй фенотипые эдэбхигүй байдалда шэлжүүлжэ, тиигэжэ HSC-эй эдэбхижүүлгэ болон митохондриин бодосой солилсоондо һаалта хэжэ элэгэй фиброзые дараха боломжые үргэдхэнэ гэжэ баталан харуулна.
Таргалалта ба бодосой солилсооной синдромой тархалтань бодосой солилсооной холбоотой өөхэн элэгэй үбшэн (MASLD)-эй нэмэгдэжэ байһан ушарнуудтай холбоотой; үбшэн ниитэ хүн зоной 25%-һаа 30% хүрэтэр нүлөөлдэг [1]. MASLD-эй этиологиин гол үрэ дүн хадаа элэгэй фиброз болоно, энэнь фиброзно эсһээ гадуурхи матрица (ECM)-эй үргэлжэлһэн хуримталал [2] гэһэн эршэмтэй үйлэ ябаса юм. Элэгэй фиброздо хабаатай гол эсүүдынь элэгэй одото эсүүд (HSCs) болоод эдэ дүрбэн мэдээжэ фенотиптэй: намдуу, эдэбхижүүлһэн, эдэбхигүй, хүгшэрһэн [3, 4]. HSC-нуудые эдэбхижүүлжэ, намдуу хэлбэриһээ үндэр энергиин эрилтэтэй пролиферативна фибробласт шэнги эсүүдтэ трансдифференциаци хэжэ болоно, α-гөлгөр булшархайн актин (α-SMA) ба I түхэлэй коллаген (Col-I)-эй илгарал нэмэгдэнэ [5, 6]. Элэгэй фиброзой һэргээлтын үедэ эдэбхижүүлһэн HSC-нүүд апоптоз гү, али эдэбхигүй болгохо замаар усадхагдадаг. Эдэ үйлэ ябасануудта фиброгеннэ генүүдэй доошоо зохисуулха ба амидарха генүүдэй модуляци (жэшээнь NF-κB ба PI3K/Akt дохёо дамжуулха замууд) [7, 8], мүн митохондриин динамика ба үйлэ ажаллалгын хубилалтанууд [9] ороно.
Гэдэһэ дотор үйлэдбэрилэгдэдэг триптофанай метаболит индол-3-пропионой хүшэлтүрэгшын (IPA) һүнэй шүүһэнэй хэмжээ хүнэй бодосой солилсооной үбшэнүүдтэ, тэрэ тоодо MASLD-дэ буурдаг гэжэ элирүүлэгдэһэн байна [10–13]. IPA хоол хүнэһэнэй утаһанай хэрэглээтэй холбоотой, антиоксидант ба үрэһэлэй эсрэг нүлөөтэй гэжэ мэдээжэ, хоол хүнэһэнһээ үүдэһэн архигүй стеатогепатит (NASH) фенотипые in vivo болон in vitro [11–14] доройтуулдаг. Зарим баримтанууд манай урданай шэнжэлэлгэһээ ерэнэ, энэнь Kuopio Bariatric Surgery Study (KOBS)-да элэгэй фиброзтой үбшэнтэнэй һүнэй IPA хэмжээн элэгэй фиброзгүй таргалһан үбшэнтэнтэй харисуулхада бага байгаа гэжэ харуулһан байна. Үшөө тиихэдэ, бидэ IPA эмшэлгэ хүнэй элэгэй одото эсэй (LX-2) загбарта эсэй наалдалга, эсэй нүүдэл, гемопоэтик үүдэл эсэй эдэбхижүүлгын классическа тэмдэглэгшэ болохо генүүдэй илгаралые багадхажа шададаг ба элэгэй хамгаалха боломжотой метаболит болоно гэжэ харуулаабди [15]. Гэбэшье, IPA HSC апоптоз болон митохондриин биоэнергетикые эдэбхижүүлжэ элэгэй фиброзой регрессиие яажа үүсхэнэб гэжэ тодорхой бэшэ байна.
Эндэ бидэ таргалһан, харин 2-дохи түхэлэй сахарна диабетгүй (KOBS) хүнүүдэй элэгтэ апоптоз, митофаги, ута наһанай замуудаар баяжуулһан генүүдэй илгарал һүнэй IPA-тай холбоотой гэжэ харуулнабди. Үшөө тиихэдэ, IPA эдэбхижүүлһэн гемопоэтик үүдэл эсэй (HSCs) сэбэрлэлгэ ба задаралые эдэбхигүйжүүлгын замаар үүсхэжэ шадаха гэжэ бидэ олообди. Эдэ дүнгүүд IPA-гай шэнэ үүргэ элирүүлжэ, элэгэй фиброзой регрессиие дэмжэхэ боломжотой эмнэлгын зорилго болгодог.
KOBS когортын урданай шэнжэлэлгын дүнгөөр ​​элэгэй фиброзтой үбшэнтэн элэгэй фиброзгүй үбшэнтэнтэй харисуулхада IPA-гай хэмжээн бага байгаа [15]. 2-дохи түхэлэй сахарна диабетын нүлөөе хаһахын тулада бидэ 2-дохи түхэлэй сахарна диабетгүй 116 таргалһан үбшэнтэниие (дунда зэргын наһа ± SD: 46.8 ± 9.3 жэл; BMI: 42.7 ± 5.0 кг/м2) (Хүснэгтэ 1) үргэлжэлһэн KOBS шэнжэлэлгын бүлэгһөө шэнжэлэлгын хүн зон болгон абаабди [16]. Бүхы хабаадагшад бэшэмэл мэдээсэлтэй зүбшөөл үгэһэн ба шэнжэлэлгын протокол Хельсинкиин тунхаглалай (54/2005, 104/2008 ба 27/2010) ёһоор Хойто Саво можын эмнэлгын газарай ёһо зүйн хорооной зүбшөөһэн байна.
Элэгэй биопсиин дээжэнүүдые бариатрическа хирургиин үедэ абажа, уридшалан тодорхойлһон шалгуурнуудаар дүршэлтэй патологууд гистологическа үнэлгэ хэһэн байна [17, 18]. Сэгнэлтын шалгуурнуудые нэмэлтэ таблица S1-дэ тобшолол хэжэ, уридшалан тодорхойлһон байна [19].
Мацаг бариха һүнэй дээжые метаболомикын шэнжэлэлгын тулада зорилгогүй шэнгэн хроматографи-масс-спектрометриин (LC-MS) аргаар шэнжэлһэн байна (n = 116). Дээжые уридшалан тодорхойлһон ёһоор UHPLC-qTOF-MS системэ (1290 LC, 6540 qTOF-MS, Agilent Technologies, Waldbronn, Karlsruhe, Germany) хэрэглэн шэнжэлһэн байна19. Изопропиловэ спирт (IPA) тодорхойлолго хадгалха хугасаа болон MS/MS спектрые сэбэр стандартнуудтай зэргэсүүлһэн дээрэ үндэһэлэгдэһэн байна. IPA дохёоной эршэм хүсэн (орьёлой талмай) бүхы саашанхи шэнжэлэлнүүдтэ хараадаа абтаһан байна [20].
Бүхы элэгэй РНК-гай дараалал Illumina HiSeq 2500 хэрэглэн хэгдэһэн ба мэдээсэлнүүдые уридшалан тодорхойлһон ёһоор уридшалан болбосоруулһан [19, 21, 22]. Бидэ MitoMiner 4.0 мэдээсэлэй санһаа шэлэгдэһэн 1957 генүүдые хэрэглэн митохондриин үйлэ ажаллалгада/биогенездэ нүлөөлдэг транскриптнүүдэй зорюулагдаһан дифференциальна илгаралгын шэнжэлэл хээбди [ 23 ]. Элэгэй ДНХ-эй метилированиин шэнжэлэлые Infinium HumanMethylation450 BeadChip (Illumina, San Diego, CA, USA) хэрэглэн урид тодорхойлһон арга хэрэглэн хэгдэһэн байна [24, 25].
Хүнэй элэгэй одото эсүүдые (LX-2) профессор Стефано Ромео һайнаар үгэжэ, DMEM/F12 оршондо (Biowest, L0093-500, 1% Pen/Strep; Lonza, DE17-602E, 2% FBS; Gibco, 100-17-16) үрэжүүлжэ, хадгалһан байна. IPA-гай ажалай тун шэлэхэдээ, LX-2 эсүүдые 24 саг соо DMEM/F12 оршон соо IPA-гай ондо ондоо концентрацитай (10 мкМ, 100 мкМ ба 1 мМ; Sigma, 220027) эмшэлһэн байна. Үшөө тиихэдэ, IPA-гай HSC-ые эдэбхигүй болгохо шадабариие шэнжэлхын тулада LX-2 эсүүдые 5 нг/мл TGF-β1 (R&D systems, 240-B-002/CF) ба 1 мМ IPA-тай хамта 24 саг соо һүнэй шүүһэнгүй оршондо эмшэлһэн байна. Тааруу тээбэриин хяналтын түлөө TGF-β1 эмшэлгэ хэхэдээ 0.1% BSA агуулһан 4 нМ HCL, IPA эмшэлгэ хэхэдээ 0.05% DMSO хэрэглэбэ, хоюулыень хос эмшэлгэ хэхэдээ хамта хэрэглэбэ.
Апоптозые үйлэдбэрилэгшын заабариин ёһоор 7-AAD (Biolegend, San Diego, CA, USA, Cat# 640922)-тай FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit хэрэглэн сэгнэһэн байна. Тобшохоноор хэлэбэл, LX-2 (1 × 105 эс/худаг) 12 худагтай хабтаһануудта һүниин туршада ургуулжа, удаань IPA гү, али IPA ба TGF-β1-эй олон тунгаар эмшэлһэн байна. Хойто үдэрынь һэлбэжэ байһан ба наалданхай эсүүдые суглуулжа, трипсинжүүлжэ, PBS-ээр угаагаад, Annexin V холбохо буфертэ дахин суспендироваад, FITC-Annexin V ба 7-AAD-тай 15 мин инкубаци хэбэ.
Амида эсэй митохондринуудые MitotrackerTM Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA) хэрэглэн исэлдэлтын эдэбхитэй байдалые шэнжэлһэн байна. MTR шэнжэлэлгын тулада LX-2 эсүүдые IPA ба TGF-β1-тэй адли нягтаар инкубаци хэбэ. саг үнгэрһэн хойно амиды эсүүдые трипсинжүүлжэ, PBS-ээр угаагаад, 100 мкМ MTR-тэй һүнэй шүүһэнгүй оршондо 37 °C-та 20 мин уридшалан тодорхойлһон ёһоор инкубаци хэбэ [ 26 ]. Амида эсэй морфологиин шэнжэлэлгын тулада эсэй хэмжээ ба цитоплазмын нарибшалан шэнжэлэлгэ тус тусдаа урагшаа тархалта (FSC) ба хажуу тээшээ тархалта (SSC) параметрнүүдые хэрэглэн хэгдэһэн байна.
Бүхы мэдээсэлнүүдые (30,000 үйлэ хэрэгүүд) NovoCyte Quanteon (Agilent) хэрэглэн абажа, NovoExpress® 1.4.1 гү, али FlowJo V.10 программын ашаар шэнжэлһэн байна.
Хүшэлтүрэгшын хэрэглээ (OCR) ба эсһээ гадуурхи хүшэлтүрэгшын хэмжээ (ECAR) үйлэдбэрилэгшын заабариин ёһоор Seahorse XF Cell Mito Stress-ээр тоноглогдоһон Seahorse Extracellular Flux Analyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) хэрэглэн бодото сагта хэмжэгдэһэн байна. Тобшохоноор хэлэбэл, 2 × 104 LX-2 эс/худаг XF96 эсэй үрэжүүлгын хабтаһанууд дээрэ таряа. Һүниин туршада инкубациин һүүлдэ эсүүдые изопропанол (IPA) ба TGF-β1 (Нэмэлтэ арга 1)-ээр эмшэлһэн байна. Мэдээлэлэй шэнжэлэлгэ Seahorse XF Wave программын ашаар хэгдэһэн, энэнь Seahorse XF эсэй энергиин фенотипэй туршалгын мэдээсэлэй генераторые багтаадаг. Энээнһээ биоэнергетикын элүүрые хамгаалгын индекс (BHI) тоосогдоо [27].
Бүхы РНК кДНХ-дэ транскрипцилэгдэһэн байна. Тодорхой аргануудые [15] харагты. Хүнэй 60S рибосомын хүшэлтүрэгшын уураг P0 (RPLP0) ба циклофилин A1 (PPIA) мРНК-гай хэмжээе бүридүүлэгшэ генэй ударидалга болгон хэрэглэбэ. QuantStudio 6 pro Real-Time PCR System (Thermo Fisher, Landsmeer, The Netherlands) TaqManTM Fast Advanced Master Mix Kit (Applied Biosystems) гү, али Sensifast SYBR Lo-ROX Kit (Bioline, BIO 94050)-тай хамта хэрэглэгдэжэ, харисангы генэй илгарал C параметрнүүд (ΔΔCt) ба ∆∆Ct арга. Праймернууд тухай дэлгэрэнгы мэдээсэл S2 ба S3 нэмэлтэ таблицануудта үгтэнэ.
Ядроной ДНХ (ncDNA) ба митохондриин ДНХ (mtDNA) урид тодорхойлһон ёһоор DNeasy шуһан ба эдэй комплект (Qiagen) хэрэглэн гаргажа абаһан [28]. mtDNA-гай харисангы хэмжээе нэмэлтэ арга 2-до дэлгэрэнгыгээр үгтэһэн ёһоор, зорилготой mtDNA-гай бүһэ нютаг бүхэнэй гурбан ядрогой ДНК-гай бүһэ нютагуудай (mtDNA/ncDNA) геометрическэ дунда зэргын харисаае тоосоолһон байна. mtDNA ба ncDNA-гай праймернууд тухай дэлгэрэнгы мэдээсэл нэмэлтэ таблица S4-дэ үгтэнэ.
Эс хоорондын ба эс доторхи митохондриин сүлжээнүүдые харуулхын тулада амиды эсүүдые MitotrackerTM Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA) будажа абаһан байна. LX-2 эсүүдые (1 × 104 эс/худаг) шэл слайд дээрэ шэл ёроолтой үрэжүүлгын хабтаһануудта (Ibidi GmbH, Martinsried, Germany) үрэжүүлһэн байна. саг үнгэрһэн хойно амиды LX-2 эсүүдые 100 мкМ MTR-тэй 37 °C-та 20 мин инкубаци хэжэ, эсэй голнуудые уридшалан тодорхойлһон ёһоор DAPI-ээр (1 мкг/мл, Sigma-Aldrich) будажа абаһан байна [29]. Митохондриин сүлжээнүүдые Zeiss Axio Observer урбуу микроскоп (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena, Germany) хэрэглэн Zeiss LSM 800 конфокальна модультай 37 °C-та 5% CO2-тай чийгшүүлһэн агаар мандалда 63×NA 1.3 объектив хэрэглэн харуулһан байна. Бидэ дээжэ бүхэндэ арбан Z-сериин зурагуудые абаабди. Z-сери бүхэн 30 хэһэгтэй, тус бүринь 9.86 мкм зузаантай. Дээжын бүхэндэ ZEN 2009 программын (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena, Germany) ашаар арбан ондо ондоо хараанай талбариин дүрсэнүүдые абаһан, нэмэлтэ аргануудта дэлгэрэнгыгээр үгтэһэн параметрнүүдэй ёһоор ImageJ программын (v1.54d) [30, 31] хэрэглэн митохондриин морфологиин шэнжэлэл хэгдэһэн байна.
Эсүүдые 0.1 М фосфат буфер соо 2% глутаральдегидээр бэхижүүлжэ, удаань 1% осмиин тетроксидэй уһанда (Sigma Aldrich, MO, USA) бэхижүүлжэ, аажамаар ацетоноор (Merck, Darmstadt, Germany) шэнгээжэ, һүүлдэнь эпоксиднэ давирхай соо нэбтэрүүлһэн байна. Хэтэ нимгэн хэһэгүүдые бэлдэжэ, 1% уранилацетат (Merck, Darmstadt, Germany) ба 1% хар тугалганай цитрат (Merck, Darmstadt, Germany)-ээр будажа абаһан байна. Хэт бүтэсэтэй зурагуудые JEM 2100F EXII дамжуулгын электрон микроскоп (JEOL Ltd, Tokyo, Japan) хэрэглэн 80 кВ хурдадхаха хүшэлтүрэгшэтэйгээр абаһан байна.
саг соо IPA-тай эмшэлһэн LX-2 эсэй морфологиие Zeiss-эй урбуу гэрэлэй микроскоп (Zeiss Axio Vert.A1 ба AxioCam MRm, Jena, Germany) хэрэглэн 50 дахин томо болгоһон фазын илгаатай микроскопоор шэнжэлһэн байна.
Эмнэлгын мэдээсэлые дунда зэргын ± стандарт хазагайралта гү, али дунда зэргын (квартиль хоорондын диапазон: IQR) гэжэ тэмдэглэбэ. Гурбан шэнжэлэлгын бүлэгүүдэй хоорондохи илгаануудые зэргэсүүлхын тулада дисперсиин нэгэ тээшээ шэнжэлэл (үргэлжэлһэн хубилагшад) гү, али χ2 тест (категориин хубилагшад) хэрэглэгдээ. Олон туршалгануудые заһахын тулада худал эерэг үрэ дүн (FDR) хэрэглэгдээ, FDR < 0.05 генүүдые статистикын удха шанартай гэжэ үзэбэ. Спирманай корреляциин шэнжэлэлые CpG ДНХ-эй метилированиие IPA дохиной эршэмтэй холбохын тулада хэрэглэбэ, нэрлэмэл p сэнгүүдые (p < 0.05) мэдээсэбэ.
Замай шэнжэлэл 268 транскрипт (нэрлэмэл p < 0.01), 119 митохондритай холбоотой транскрипт (нэрлэмэл p < 0.05), 3093 элэгэй транскриптһээ 4350 CpG-эй генэй багтаамжын шэнжэлэлгын хэрэгсэл (WebGestalt) хэрэглэн хэгдэһэн байна. Сүлөөтэ үгтэхэ Venny DB (2.1.0 хубилалта) хэрэгсэлые дабхарлаһан генүүдые олохын тулада хэрэглэбэ, харин StringDB (11.5 хубилалта) уураг-уураг харилсан үйлэшэлэлгэ харуулхын тулада хэрэглэбэ.
LX-2 туршалга хэхэдээ, дээжэнүүдые D'Agostino-Pearson тест хэрэглэн ёһотойл байдалые шалгаһан байна. Мэдээллые дор хаяжа гурбан биологическа дабталгаһаа абажа, Бонферрониин һүүлшын туршалгатай нэгэ тээшээ ANOVA-да оруулһан байна. 0.05-һаа бага p-үнэлгэ статистикын удха шанартай гэжэ үзэбэ. Мэдээсэлнүүд дунда зэргын ± SD гэжэ харуулагдана, туршалгануудай тоо зураг бүхэндэ харуулагдана. Бүхы шэнжэлэлнүүд болон графигуудые Windows-то зориулһан GraphPad Prism 8 статистикын программна хангамжаар (GraphPad Software Inc., 8.4.3 хубилалта, Сан-Диего, АНУ) хэһэн байна.
Нэгэдэхеэр, бидэ һүнэй IPA хэмжээнэй элэг, бүхы бэеын болон митохондриин транскрипттэй холбоое шэнжэлээбди. Ниитэ транскриптын профильда һүнэй IPA хэмжээтэй холбоотой эгээл хүсэтэй ген MAPKAPK3 (FDR = 0.0077; митогенээр эдэбхижүүлһэн уураг киназаар эдэбхижүүлһэн уураг киназа 3); митохондритай холбоотой транскриптын профильда эгээл хүсэтэй холбоотой ген AKT1 (FDR = 0.7621; AKT серин/треонин киназа 1) (Нэмэлтэ файл 1 ба Нэмэлтэ файл 2) байгаа.
Удаань бидэ дэлхэйн транскриптнүүдые (n = 268; p < 0.01) ба митохондритай холбоотой транскриптнүүдые (n = 119; p < 0.05) шэнжэлжэ, эгээ һүүлдэ апоптозые эгээл шухала канон зам гэжэ тодорхойлбобди (p = 0.0089). Сыворотка IPA хэмжээтэй холбоотой митохондриин транскриптнүүдэй түлөө бидэ апоптоз (FDR = 0.00001), митофаг (FDR = 0.00029), ба TNF дохёо дамжуулха замууд (FDR = 0.000006) (Зураг 1А, таблица 2, ба нэмэлтэ зурагууд 1A-B) дээрэ анхаралаа хандуулһан байнабди.
Дэлхэйн, митохондритай холбоотой транскриптнүүдэй, хүнэй элэгтэ ДНХ-эй метилированиин һүнэй IPA хэмжээнтэй холбоотойгоор дабхар шэнжэлэлгэ. А 268 дэлхэйн транскрипт, 119 митохондритай холбоотой транскрипт, ДНХ-ээр метилированна транскриптнүүдые тэмдэглэнэ, эдэнь 3092 CpG-эй һүнэй IPA хэмжээтэй холбоотой газарнуудта харуулагдана (дэлхэйн транскрипт болон ДНХ-эй метилированна транскриптын p сэн < 0.01, митохондриин транскриптын p сэн < 0.00). Гол дабхарлаһан транскриптнүүд дундань харуулагдана (AKT1 ба YKT6). B бусад генүүдтэй эгээл ехэ харилсан үйлэшэлэлэй сэгнэлтэтэй (0.900) 13 генүүдэй харилсан үйлэшэлэлэй карта StringDB онлайн хэрэгсэл хэрэглэн һүнэй IPA хэмжээнтэй нягта холбоотой 56 дабхарлаһан генүүдһээ (хара шугамай бүһэ) бүтээгдэһэн байна. Ногоон: Генэй онтологи (GO) эсэй бүридүүлэгшэ: митохондри (GO:0005739) руу харуулһан генүүд. AKT1 хадаа мэдээсэл дээрэ үндэһэлһэн бусад уурагуудтай харилсан үйлэшэлэлэй эгээн үндэр сэгнэлтэтэй (0.900) уураг (текст олборилолто, туршалганууд, мэдээсэлэй сан, хамтын илгарал дээрэ үндэһэлһэн). Сүлжээнэй зангилаанууд уурагуудые тэмдэглэнэ, харин ирмэгынь уурагуудай хоорондохи холбоонуудые тэмдэглэнэ.
Гэдэһэнэй микробиотын метаболитууд ДНХ-эй метилированиин ашаар эпигенетикын бүридэлые зохисуулха аргатай тула [32], бидэ һүнэй IPA хэмжээн элэгэй ДНХ-эй метилированитай холбоотой гү гэжэ шэнжэлээбди. Сыворотка IPA хэмжээтэй холбоотой хоёр гол метилированиин газарнууд пролин-серинээр баялиг 3-дахи бүһэ (C19orf55) ба дулаанай шокын уураг В бүлэгэй (бага) гэшүүн 6 (HSPB6) ойролсоо байгаа гэжэ бидэ олообди (Нэмэлтэ файл 3). 4350 CpG-эй ДНХ-эй метилировани (p < 0.01) һүнэй IPA хэмжээнтэй холбоотой байгаа ба ута наһанай зохисуулха замуудаар баяжуулагдаһан (p = 0.006) (Зураг 1А, таблица 2, ба нэмэлтэ зураг 1С).
Хүнэй элэгтэ һүнэй IPA хэмжээ, дэлхэйн транскрипт, митохондритай холбоотой транскрипт, ДНХ-эй метилированиин хоорондохи холбоонуудые ойлгохын тулада бидэ урданай зам шэнжэлэлгын үедэ элирүүлһэн генүүдэй дабхар шэнжэлэл хээбди (Зураг 1А). дабхарлаһан генүүдэй зам баяжуулгын шэнжэлэлгын дүнгүүд (Зураг 1А-да хара зурлаа дотор) апоптозын зам (p = 0.00029) гурбан шэнжэлэлгын ниитэ хоёр генүүдые онсолһон байна: AKT1 ба YKT6 (YKT6 v-SNARE гомолог), Venegram ба Зураг 2-до харуулагдана 1А). Һонирхолтойнь гэхэдэ, AKT1 (cg19831386) ба YKT6 (cg24161647) һүнэй IPA хэмжээнтэй һайнаар холбоотой гэжэ бидэ олообди (Нэмэлтэ файл 3). Генэй бүтээгдэхүүнэй хоорондохи боломжотой уураг харилсан үйлэшэлэлгэнүүдые элирүүлхын тулада бидэ 56 дабхарлаһан генүүдэй дундаһаа эгээн үндэр ниитэ бүһын сэгнэлтэтэй (0.900) 13 генүүдые оролто болгон шэлэжэ, харилсан үйлэшэлэлэй карта бүтээгээбди. Найдабариин хэмжээнэй ёһоор (захын найдабари), эгээл ехэ сэгнэлтэтэй (0.900) AKT1 ген дээдэ шатада байгаа (Зураг 1В).
Замай шэнжэлэлгын үндэһөөр бидэ апоптоз гол зам гэжэ элирүүлээбди, тиимэһээ бидэ IPA эмшэлгэ in vitro HSC-эй апоптоздо нүлөөлхэ гү гэжэ шэнжэлээбди. Бидэ уридшалан IPA-гай ондо ондоо тун (10 μM, 100 μM, ба 1 mM) LX-2 эсүүдтэ хоротой бэшэ гэжэ харуулаа һэмди [15]. Энэ шэнжэлэлгын дүнгөөр ​​10 мкМ ба 100 мкМ-эй IPA эмшэлгэ амидарха шадалтай ба үхэлэй эсэй тоое нэмэгдүүлһэн байна. Гэбэшье, хяналтын бүлэгтэй харисуулхада, эсэй амидарал 1 мМ IPA концентрацида буурһан болобошье эсэй үхэлэй хурдадхал хубилхагүй байгаа (Зураг 2А, В). Удаань, LX-2 эсүүдтэ апоптоз үүсхэхэ оностой концентраци олохын тулада бидэ 10 мкМ, 100 мкМ, 1 мМ IPA 24 саг соо туршабабди (Зураг 2А-Е ба Нэмэлтэ Зураг 3А-В). Һонирхолтойнь гэхэдэ, IPA 10 мкМ ба 100 мкМ апоптозой хурдые (%) бууруулжа, гэбэшье IPA 1 мМ һүүлшын апоптоз ба апоптозын хурдые (%) хяналтынхитай харисуулхада нэмэгдүүлһэн тула саашанхи туршалгануудта шэлэгдэбэ (Зураг 2А–D).
IPA LX-2 эсэй апоптоз үүсхэнэ. Апоптозой хурдые ба эсэй морфологиие гүйдэлэй цитометриин аргаар тодорхойлхын тулада Аннексин V ба 7-AAD хоёр дахин будалга хэрэглэбэ. БА эсүүдые 10 мкМ, 100 мкМ ба 1 мМ IPA-тай 24 саг соо гү, али F–H TGF-β1 (5 нг/мл) ба 1 мМ IPA-тай 24 саг соо һүнгүй оршондо инкубаци хэбэ. А: амиды эсүүд (Аннексин V -/ 7AAD-); Б: үхэһэн эсүүд (Аннексин V -/ 7AAD+); C, F: эртэ (Хабсаргалта V +/ 7AAD-); D, G: һүүлдэ (Хабсаргалта V+/7AAD.+); E, H: апоптозой хэмжээндэ эртын ба һүүлшын апоптозой эсэй ниитэ хуби (%). Мэдээллые дунда зэргын ± SD, n = 3 бэеэ дааһан туршалганууд гэжэ харуулна. Статистикын зэргэсүүлгэнүүдые Bonferroni post hoc тесттэй нэгэ тээшээ ANOVA хэрэглэн хэгдэһэн байна. *p < 0.05; ****p < 0.0001
Урдань харуулһандал, 5 нг/мл TGF-β1 классическа маркер генүүдэй илгаралые нэмэгдүүлжэ HSC эдэбхижүүлгэ үүсхэжэ шадаха [15]. LX-2 эсүүдые 5 нг/мл TGF-β1 ба 1 мМ IPA хослуулан эмшэлһэн байна (Зураг 2Е–Н). TGF-β1 эмшэлгэ апоптозой хэмжээе хубилгаагүй, гэбэшье IPA-тай хамта эмшэлгэ TGF-β1 эмшэлгэтэй харисуулхада һүүлшын апоптоз ба апоптозой хэмжээе (%) нэмэгдүүлһэн байна (Зураг 2Е–Н). Эдэ дүнгүүд 1 мМ IPA TGF-β1 үүсхэлһээ үл хамааран LX-2 эсүүдтэ апоптозые дэмжэжэ шададаг гэжэ харуулна.
Бидэ LX-2 эсүүдэй митохондриин амилалгада IPA-гай нүлөөе саашань шэнжэлээбди. Дүн гаргалгын ёһоор 1 мМ IPA хүшэлтүрэгшын хэрэглээгэй хурдадхал (OCR) үзүүлэлтые бууруулжа байна: митохондриин бэшэ амилалга, үндэһэн ба эгээн ехэ амилалга, протоной нэбтэрэлгэ ба АТФ үйлэдбэрилэл хяналтын бүлэгтэй харисуулхада (Зураг 3А, В), харин биоэнергетикын элүүрые хамгаалгын индекс (BHI) хубилагдаагүй.
IPA LX-2 эсүүдэй митохондриин амилалга багадхадаг. Митохондриин амисхалай муруй (OCR) митохондриин амисхалай үзүүлэлтээр (митохондриин бэшэ амисхаал, үндэһэн амисхаал, эгээн ехэ амилалга, протоной алдагдал, АТФ-эй бии бололго, SRC ба BHI) харуулагдана. А ба В эсүүдые тус тусдаа 10 мкМ, 100 мкМ ба 1 мМ IPA-тай 24 саг соо инкубаци хэбэ. С ба D эсүүдые TGF-β1 (5 нг/мл) ба 1 мМ IPA-тай 24 саг соо тус тусдаа һүнэй шүүһэнгүй оршондо инкубаци хэбэ. Бүхы хэмжүүрнүүдые CyQuant комплект хэрэглэн ДНХ-эй агуулгада тааруулһан байна. BHI: биоэнергетикын элүүрые хамгаалгын индекс; SRC: амисхалай нөөсэ багтаамжа; OCR: хүшэлтүрэгшын хэрэглээ. Мэдээллые дунда зэргын ± стандарт хазагайралта (SD) гэжэ харуулаа, n = 5 бэеэ дааһан туршалганууд. Статистикын зэргэсүүлгэнүүдые нэгэ тээшээ ANOVA ба Bonferroni post hoc тест хэрэглэн хэгдэһэн байна. *p < 0.05; **p < 0.01; ба ***p < 0.001
TGF-β1-ээр эдэбхижүүлһэн LX-2 эсэй биоэнергетикын профильда IPA-гай нүлөөн тухай дэлгэрэнгы ойлгосо абахын тулада бидэ OCR-ээр митохондриин исэлдэлтын фосфорилированиие шэнжэлээбди (Зураг 3C,D). Дүн гаргалгын ёһоор TGF-β1 эмшэлгэ хяналтын бүлэгтэй харисуулхада эгээн ехэ амисхаал, амисхалай нөөсэ багтаамжа (SRC) ба BHI-ые багадхажа шадаһан байна (Зураг 3C,D). Нэмэжэ хэлэхэдэ, хос эмшэлгэ һууриин амилалга, протоной нэбтэрэлгэ ба АТФ үйлэдбэрилэлые бууруулһан болобошье SRC ба BHI TGF-β1-ээр эмшэлһэнһээ мэдэгдэхүйсэ үндэр байгаа (Зураг 3С,D).
Мүн Seahorse программын үгэһэн “Эсэй энергиин фенотипэй туршалга” хэбэбди (Нэмэлтэ зураг 4A–D). Нэмэлтэ зураг 3В-дэ харуулһандал, TGF-β1 эмшэлгын һүүлдэ OCR ба ECAR хоерой бодосой солилсооной боломжонууд буурһан, гэбэшье, хослол ба IPA эмшэлгын бүлэгүүдтэ хяналтын бүлэгтэй харисуулхада ямаршье илгаа тэмдэглэгдээгүй. Үшөө тиихэдэ, OCR-эй үндэһэн ба стрессэй хэмжээнүүд хоюулаа хослол ба IPA эмшэлгын һүүлдэ хяналтын бүлэгтэй харисуулхада буурһан байна (Нэмэлтэ зураг 4С). Һонирхолтойнь гэхэдэ, хос эмнэлгэтэй адлирхуу хэб маяг ажаглагдаа, эндэ TGF-β1 эмнэлгэтэй харисуулхада ECAR-эй үндэһэн ба стрессэй хэмжээндэ ямаршье хубилалта ажаглагдаагүй (Нэмэлтэ зураг 4С). HSC-дэ митохондриин исэлдэлтын фосфорилированиин бууралга ба TGF-β1 эмшэлгэтэй холбоотойгоор SCR ба BHI һэргээхэ хос эмшэлгын шадабари бодосой солилсооной боломжые (OCR ба ECAR) хубилгаагүй. Эдэ дүнгүүдые хамтадхабал, IPA HSC-нүүдэй биоэнергетикые багадхажа магадгүй гэжэ харуулна, энэнь IPA HSC-эй фенотипые эдэбхигүй болгохо тээшэ шэлжүүлдэг доодо энергиин профиль үүсхэжэ магадгүй гэжэ тэмдэглэнэ (Нэмэлтэ зураг 4D).
IPA-гай митохондриин динамикада үзүүлхэ нүлөөе митохондриин морфологи болон сүлжээнэй холбоонуудые гурбан хэмжээнэй тоосоололго болон MTR будалга хэрэглэн шэнжэлһэн байна (Зураг 4 ба Нэмэлтэ Зураг 5). 4-дэхи зураг дээрэ харуулһанаар, хяналтын бүлэгтэй харисуулхада, TGF-β1 эмшэлгэ дунда зэргын гадаргуугай талмай, һалаануудай тоо, һалаануудай ниитэ ута, һалаануудай холбооной тоо (Зураг 4А ба В) багадхажа, митохондриин хубиие бүмбэрсэгһөө дунда зэргын морфологидо хубилгаа (Зураг 4С). Гансал IPA эмшэлгэ дунда зэргын митохондриин хэмжээе багадхажа, хяналтын бүлэгтэй харисуулхада митохондриин хубиие бүмбэрсэгһөө дунда зэргын морфологидо хубилгаа (Зураг 4А). Харин митохондриин мембранай потенциалһаа дулдыдаха MTR-ээр сэгнэгдэһэн бүмбэрсэг байдал, дунда зэргын һалаа ута, митохондриин үйлэ ажалалгаа (Зураг 4А ба Е) хубилхагүй байгаа ба эдэ үзүүлэлтүүд бүлэгүүдэй хоорондо илгардаггүй байгаа. Эдэ дүнгүүдые хамтадхабал, TGF-β1 ба IPA эмшэлгэ амиды LX-2 эсүүдэй митохондриин хэлбэри ба хэмжээе, мүн сүлжээнэй орёо байдалые хубилдаг гэжэ тэмдэглэнэ.
IPA LX-2 эсүүдэй митохондриин динамикые ба митохондриин ДНХ-эй элбэг байдалые хубилгадаг. A. MitotrackerTM Red CMXRos-ээр будагдаһан митохондриин сүлжээнүүдые ба DAPI-ээр хүхэ үнгөөр ​​будагдаһан ядронуудые харуулһан TGF-β1 (5 нг/мл) ба 1 мМ IPA-тай 24 саг соо инкубаци хэһэн амиды LX-2 эсэй түлөөлһэн конфокальна дүрсэнүүд. Бүхы мэдээсэлнүүд бүлэг бүхэндэ дор хаяжа 15 зурагтай байгаа. Дээжын түхэл бүхэндэ 10 Z-stack зурагуудые абаабди. Z-тэнхэлэгэй дараалал бүхэн 30 шэлбэтэй, тус бүринь 9.86 мкм зузаантай. Хэмжээнэй зурлаа: 10 мкм. Б. Зурагта дабшаха босоо хэмжээ хэрэглэжэ тодорхойлһон түлөөлхэ объектнүүд (ганса митохондри). Бүлэг бүхэнэй бүхы эсүүдтэ митохондриин морфологическа сүлжээнэй холбоонуудые тоогой шэнжэлэл ба зэргэсүүлгэ хэгдэһэн байна. В. Митохондриин хэлбэриин харисаанай дабтамжа. 0-дэ ойролсоо сэнгүүд бүмбэрсэг хэлбэриие харуулна, 1-дэ дүтэ сэнгүүд утаһан хэлбэриие харуулна. D Митохондриин ДНХ-эй (мтДНХ) агууламжа Материал ба аргануудта тодорхойлһон ёһоор тодорхойлогдоһон байна. E MitotrackerTM Red CMXRos шэнжэлэлые Материал ба аргануудта тодорхойлһон ёһоор гүйдэлэй цитометриин (30,000 үйлэ ябадал) аргаар хэгдэһэн байна. Мэдээсэлнүүд дунда зэргын ± SD, n = 3 бэеэ дааһан туршалгануудаар харуулагдана. Статистикын зэргэсүүлгэнүүдые нэгэ тээшээ ANOVA ба Bonferroni post hoc тест хэрэглэн хэгдэһэн байна. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001
Удаань бидэ LX-2 эсүүдэй mtDNA-гай хэмжээе митохондриин тооной үзүүлэлтээр шэнжэлээбди. Хяналтын бүлэгтэй харисуулхада, TGF-β1-ээр эмшэлһэн бүлэгтэ mtDNA-гай хэмжээн нэмэгдэһэн байна (Зураг 4D). TGF-β1-ээр эмшэлһэн бүлэгтэй харисуулхада, хос эмшэлгын бүлэгтэ mtDNA-гай агууламжа буурһан байна (Зураг 4D), энэнь IPA mtDNA-гай агууламжа болон магадгүй митохондриин тоо болон митохондриин амилалга багадхажа магадгүй гэжэ тэмдэглэнэ (Зураг 3C). Үшөө тиихэдэ, IPA хос эмшэлгэ соо mtDNA-гай хэмжээе багадхаһан шэнги байгаад, MTR-зууршалһан митохондриин үйлэ ажаллалгада нүлөөлнэгүй (Зураг 4А–С).
Бидэ LX-2 эсүүдэй фиброз, апоптоз, амидарал, митохондриин динамикатай холбоотой генүүдэй мРНК-гай хэмжээнүүдтэй IPA-гай холбоое шэнжэлээбди (Зураг 5А–D). Хяналтын бүлэгтэй харисуулхада, TGF-β1-ээр эмшэлһэн бүлэг коллагенэй I түхэлэй α2 гинжэ (COL1A2), α-гөлгөр булшархайн актин (αSMA), матрицын металлопротеиназа 2 (MMP2), металлопротеиназа 1-эй эдэй дарангылагша (TIMP1), ба RP1-тэй адли генүүдые харуулһан генүүдэй илгарал нэмэгдэһэн байна. фиброз ба эдэбхижүүлгэ нэмэгдэһэн. Үшөө тиихэдэ, хяналтын бүлэгтэй харисуулхада, TGF-β1 эмшэлгэ ядрогой прегнан X рецепторой (PXR), каспаза 8 (CASP8), MAPKAPK3, В-эсэй α дарангылагша, ядрогой фактор κ генэй гэрэлэй пептидэй (NFκB1A) нэмэгдүүлэгшэ, ядрогой фактор κB киназагай дэд нэгэдэлэй дарангылагшын мРНК-гай хэмжээе доошолуулаа (Зураг KBKB) 5А–Д). TGF-β1 эмшэлгэтэй харисуулхада, TGF-β1 ба IPA-тай хос эмшэлгэ COL1A2 ба MMP2-эй илгаралые багадхаһан болобошье PXR, TIMP1, B-эсэй лимфома-2 (BCL-2), CASP8, NFκB1A, NFκB1-β, ба IKBKB-эй мРНК-гай хэмжээе нэмэгдүүлһэн байна. IPA эмшэлгэ MMP2, Bcl-2-тай холбоотой уураг X (BAX), AKT1, оптикын атрофиин уураг 1 (OPA1), митохондриин ниилэлтын уураг 2 (MFN2)-эй илгаралые мэдэгдэхүйсэ бууруулжа, харин CASP8, NFκB1A, NFκB1B, IKB-эй илгарал хяналтын бүлэгтэй харисуулхада нэмэгдэһэн байна. Гэбэшье, каспаза-3 (CASP3), апоптозой пептидазын эдэбхижүүлгын фактор 1 (APAF1), митохондриин ниилэлтын уураг 1 (MFN1), хубаагдалай уураг 1 (FIS1)-эй илгаралда ямаршье илгаа оложо шадаагүй. Хамтадаа эдэ дүнгүүд IPA эмшэлгэ фиброз, апоптоз, амидарал, митохондриин динамикатай холбоотой генүүдэй илгаралые хубилгадаг гэжэ тэмдэглэнэ. Манай мэдээнүүд IPA эмшэлгэ LX-2 эсүүдэй фиброзые багадхадаг гэжэ тэмдэглэнэ; тэрэл үедэ энэнь фенотипые эдэбхигүй болгохо руу шэлжүүлжэ амидаралые эдэбхижүүлнэ.
IPA LX-2 эсүүдтэ фибробласт, апоптоз, амидарал, митохондриин динамикын генүүдэй илгаралые модуляци хэнэ. LX-2 эсүүдые 24 саг соо һүнэй шүүһэнгүй оршондо TGF-β1 ба IPA-тай үүсхэһэн хойно гистограмманууд эндогеннэ хяналтын (RPLP0 гү, али PPIA) харисуулан мРНК-гай илгаралые харуулна. А фибробластуудые, В апоптозой эсүүдые, С амиды үлэһэн эсүүдые, D митохондриин динамикын генэй илгаралые тэмдэглэнэ. Мэдээллые дунда зэргын ± стандарт хазагайралта (SD) гэжэ харуулаа, n = 3 бэеэ дааһан туршалганууд. Статистикын зэргэсүүлгэнүүдые нэгэ тээшээ ANOVA ба Bonferroni post hoc тест хэрэглэн хэгдэһэн байна. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001
Удаань эсэй хэмжээнэй (FSC-H) ба цитоплазмын нарибшалан (SSC-H) хубилалтануудые гүйдэлэй цитометрээр (Зураг 6А,В) сэгнэжэ, IPA эмшэлгын һүүлдэ эсэй морфологиин хубилалтануудые дамжуулгын электрон микроскопоор (TEM) ба фазын илгаатай микроскопоор (Нэмэлтэ зураг 6А-В) сэгнэбэ. Хүлээлгын ёһоор, TGF-β1-ээр эмшэлһэн бүлэгэй эсүүд хяналтын бүлэгтэй харисуулхада хэмжээгээрээ нэмэгдэһэн байна (Зураг 6А,В), энэнь шэрүүн эндоплазмын тор (ER*) ба фаголисосомын (P) классическа үргэдхэл харуулһан, энэнь гемопоэтик үүдэл эсэй (HSC) эдэбхижүүлгэ харуулһан (Нэмэлтэ зураг 6А). Гэбэшье, TGF-β1-ээр эмшэлһэн бүлэгтэй харисуулхада, TGF-β1 ба IPA хослуулан эмшэлһэн бүлэгтэ эсэй хэмжээ, цитоплазмын нарибшалан (Зураг 6А,В), ER*-эй агууламжа багадхаһан байна (Нэмэлтэ зураг 6А). Үшөө тиихэдэ, IPA эмшэлгэ хяналтын бүлэгтэй харисуулхада эсэй хэмжээ, цитоплазмын нарибшалан (Зураг 6А,В), P ба ER* агууламжа (Нэмэлтэ зураг 6А) багадхаһан байна. Нэмэжэ хэлэхэдэ, апоптозой эсэй агууламжа 24 саг соо IPA эмшэлгын һүүлдэ хяналтын бүлэгтэй харисуулхада нэмэгдэһэн байна (сагаан сумууд, нэмэлтэ зураг 6В). Хамтадаа эдэ дүнгүүд 1 мМ IPA HSC-эй апоптозые эдэбхижүүлжэ, TGF-β1-ээр үүсхэгдэһэн эсэй морфологиин үзүүлэлтэдэ хубилалтые һэргээжэ, тиигэжэ эсэй хэмжээ ба нарибшалангые зохисуулдаг, энэнь HSC-эй эдэбхигүйжүүлгэтэй холбоотой байжа болохо гэжэ тэмдэглэнэ.
IPA LX-2 эсүүдэй эсэй хэмжээ ба цитоплазмын комплексые хубилгадаг. Урдалай цитометриин шэнжэлэлгын түлөөлһэн дүрсэнүүд. Шэнжэлэлгын үедэ LX-2 эсүүдтэ тусхай үүдэлгын стратеги хэрэглэгдээ: SSC-A/FSC-A эсэй популяци тодорхойлхо, FSC-H/FSC-A дублет элирүүлхэ, SSC-H/FSC-H эсэй хэмжээ ба комплексно шэнжэлэл хэхэ. Эсүүдые TGF-β1 (5 нг/мл) ба 1 мМ IPA-тай һүнгүй оршондо 24 саг соо инкубаци хэбэ. LX-2 эсүүдые эсэй хэмжээ ба цитоплазмын комплексно шэнжэлэлгын тулада зүүн доодо дүрбэлжэн (SSC-H-/FSC-H-), зүүн дээдэ дүрбэлжэн (SSC-H+/FSC-H-), баруун доодо дүрбэлжэн (SSC-H-/FSC-H+), баруун дээдэ дүрбэлжэн (SSC-H+/FSC-H+) болгон хубааһан байна. Б. Эсэй морфологиие FSC-H (урда тархалта, эсэй хэмжээ) ба SSC-H (хажуугай тархалта, цитоплазмын нарибшалан) (30,000 үйлэ ябадал) хэрэглэн гүйдэлэй цитометриин аргаар шэнжэлһэн байна. Мэдээсэлнүүд дунда зэргын ± SD, n = 3 бэеэ дааһан туршалгануудаар харуулагдана. Статистикын зэргэсүүлгэнүүдые нэгэ тээшээ ANOVA ба Bonferroni post hoc тест хэрэглэн хэгдэһэн байна. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001 ба ****p < 0.0001
IPA мэтэ гэдэһэнэй метаболитууд шэнжэлэлгын халуун сэдэб боложо, гэдэһэнэй микробиотада шэнэ зорилгонуудые оложо болохо гэжэ тэмдэглэнэ. Тиимэһээ IPA, хүнэй элэгэй фиброзтой холбоһон [15] метаболит, амитадай загбарта фиброздо эсэргүү боломжотой нэгэдэл гэжэ элирүүлэгдэһэниинь һонирхолтой [13, 14]. Эндэ бидэ 2-дохи түхэлэй сахарна диабет (T2D)гүй таргалһан хүнүүдэй һүнэй IPA ба дэлхэйн элэгэй транскриптомик ба ДНХ-эй метилированиин хоорондохи холбоое анха түрүүшынхиеэ харуулжа, апоптоз, митофаги ба ута наһа наһалха, мүн элэгэй гомеостазые зохисуулдаг AKT1 генэй боломжотой кандидат геные онсолон харуулнабди. Манай шэнжэлэлгын үшөө нэгэ шэнэ зүйл гэхэдэ, бидэ IPA эмшэлгэ LX-2 эсэй апоптоз, эсэй морфологи, митохондриин биоэнергетикэ болон динамикатай харилсан үйлэшэлэлгэ харуулһан байнабди, энэнь HSC фенотипые эдэбхигүй болгохо тээшэ шэлжүүлдэг доодо энергиин спектрые харуулһан болоод IPA-ые элэгэй фиброзые һайжаруулха боломжотой кандидат болгодог.
Апоптоз, митофаги ба ута наһа наһалха гээшэ эргэлдэжэ байһан һүнэй IPA-тай холбоотой элэгэй генүүдээр баяжуулагдаһан эгээл шухала каноническа замууд гэжэ бидэ олообди. Митохондриин шанарай хяналтын (MQC) системын таһаралта митохондриин үйлэ ажаллалгын алдагдалда, митофагида ба апоптоздо хүргэжэ, тиигэжэ MASLD-эй бии бололго дэмжэнэ [33, 34]. Тиимэһээ IPA элэгэй апоптоз, митофаг болон ута наһалалта дамжуулан эсэй динамика болон митохондриин бүтэн байдалые хадгалхада хабаатай байжа болохо гэжэ бидэ таамаглажа болоно. Манай мэдээнүүд гурбан шэнжэлэлгын хоёр ген ниитэ байгаае харуулаа: YKT6 ба AKT1. YKT6 хадаа эсэй мембранай ниилэлтын үйлэ ябасада хабаададаг SNARE уураг гэжэ тэмдэглэхэ шухала. Энэнь аутофагосом дээрэ STX17 ба SNAP29-тэй эхилэлтын комплекс бии болгожо, аутофагосом ба лизосомын ниилэлтые дэмжэжэ, аутофаг ба митофагта үүргэ гүйсэдхэнэ [35]. Үшөө тиихэдэ YKT6-ай үйлэ ажалалгаа алдагдахада митофагиин бууралга үүсхэдэг [36], харин YKT6-ай дээшэлүүлгэ гепатоцеллюлярна карцинома (HCC)-эй үргэлжэлэлтэй холбоотой болоод эсэй амидарал нэмэгдэһэн байна [37]. Нүгөө талаһаа, AKT1 хадаа эгээн шухала харилсан үйлэшэлдэг ген болоод элэгэй үбшэнүүдтэ шухала үүргэ гүйсэдхэнэ, энэ тоодо PI3K/AKT дохёо дамжуулха зам, эсэй цикл, эсэй нүүдэл, үржэхэ, фокус наалдалга, митохондриин үйлэ ажалалгаа, коллагенэй секреци [38–40]. Идэбхижүүлһэн PI3K/AKT дохёо дамжуулха зам гемопоэтик үүдэл эсүүдые (HSCs) эдэбхижүүлжэ шадаха ба энэнь эсһээ гадуурхи матрица (ECM) үйлэдбэрилхэ харюусалгатай эсүүд юм, тиигээд тэрэнэй дисрегуляци элэгэй фиброзой бии бололго ба үргэлжэлэлдэ хубита оруулдаг [40]. Нэмэжэ хэлэхэдэ, AKT p53-һаа дулдыдаха эсэй апоптозые дараха эсэй амидаралай гол хүшэлтүрэгшэдэй нэгэн болоод AKT эдэбхижүүлгэ элэгэй эсэй апоптозые даралтатай холбоотой байжа болоно [41, 42]. Олдоһон дүнгүүд IPA элэгэй митохондритай холбоотой апоптоздо хабаатай байжа болохо гэжэ тэмдэглэнэ, энэнь апоптоздо орохо гү, али амидарха хоорондохи гепатоцитүүдэй шиидхэбэридэ нүлөөлнэ. Эдэ нүлөөнүүдые элэгэй гомеостазда шухала үүргэтэй AKT ба/гү, али YKT6 кандидат генүүд зохисуулдаг.
Манай дүнгүүд 1 мМ IPA TGF-β1 эмшэлгэһээ дулдыдангүй LX-2 эсүүдтэ апоптоз үүсхэжэ, митохондриин амилалга бууруулжа байһые харуулаа. Апоптоз хадаа фиброзые шиидхэхэ ба гемопоэтик үүдэл эсэй (HSC) эдэбхижүүлгын гол зам болоод элэгэй фиброзой эргэлзээтэй физиологическа харюугай гол үйлэ ябадал болоно гэжэ тэмдэглэхэ хэрэгтэй [4, 43]. Үшөө тиихэдэ, хос эмшэлгын һүүлдэ LX-2 эсүүдтэ BHI-ые һэргээхэ нь митохондриин биоэнергетикые зохисуулхада IPA-гай боломжотой үүргэ тухай шэнэ ойлголто үгэбэ. Амаралтын ба эдэбхигүй байдалда гемопоэтик эсүүд еһо заншалаар митохондриин исэлдэлтын фосфорилированиие хэрэглэн АТФ үйлэдбэрилдэг ба бодосой солилсооной эдэбхи багатай байдаг. Нүгөө талаһаа, HSC эдэбхижүүлгэ митохондриин амилалга ба биосинтезые дээшэлүүлжэ, гликолитик байдалда орохо эршэм хүсэнэй хэрэглээе нэмэгдүүлнэ [44]. IPA-гай бодосой солилсооной боломжо болон ECAR-да нүлөөлдэггүй байһаниинь гликолитикын замые бага түрүүлдэг гэжэ тэмдэглэнэ. Үшөө нэгэ шэнжэлэлгын дүнгөөр ​​1 мМ IPA кардиомиоцит, хүнэй гепатоцит эсэй шугам (Huh7) болон хүнэй хүйһэнэй венэдэ эндотелиин эс (HUVEC)-да митохондриин амьсгалха гинжын үйлэ ажаллалгые модуляци хэжэ шададаг; Гэбэшье, IPA-гай кардиомиоцитүүдэй гликолиздэ ямаршье нүлөө оложо шадаагүй, энэнь IPA бусад эсэй түхэлэй биоэнергетикэдэ нүлөөлжэ магадгүй гэжэ тэмдэглэнэ [45]. Тиимэһээ 1 мМ IPA мтДНК-гай хэмжээе хубилгахагүйгөөр фиброгеннэ генэй илгарал, эсэй морфологи болон митохондриин биоэнергетикые ехээр багадхажа шадаха тула хүнгэн химиин һалгаагша үүргэ дүүргэхэ аргатай гэжэ бидэ таамаглажа байнабди [46]. Митохондриин һалгаагшад соёлой үүсхэһэн фиброз ба HSC эдэбхижүүлгые [47] даража, һалгаха уурагууд (UCP) гү, али аденин нуклеотид транслоказа (ANT) гэхэ мэтэ тодорхой уурагуудаар зохисуулагдаһан гү, али үүсхэгдэһэн митохондриин АТФ үйлэдбэрилэлые багадхажа шадаха. Эсэй түхэлһөө дулдыдажа, энэ үзэгдэл эсые апоптозһоо хамгаалха ба/гү, али апоптозые дэмжэхэ аргатай [46]. Гэбэшье, IPA-гай гемопоэтик үүдэл эсэй эдэбхигүйжүүлгэдэ митохондриин һалгаагша үүргэтэйе элирүүлхын тулада саашадаа шэнжэлэлнүүд хэрэгтэй.
Удаань бидэ амиды LX-2 эсүүдэй митохондриин морфологидо митохондриин амисхалай хубилалтанууд харагдана гү гэжэ шэнжэлээбди. Һонирхолтойнь гэхэдэ, TGF-β1 эмшэлгэ митохондриин хубиие бүмбэрсэгһөө дунда зэргын болгожо хубилгадаг, энэнь митохондриин һалбарилалта бууража, митохондриин хубаагдалай гол хүшэлтүрэгшэ болохо DRP1-эй илгарал нэмэгдэдэг [48]. Үшөө тиихэдэ, митохондриин хубаагдал ниитэ сүлжээнэй нарибшалантай холбоотой болоод ниилэлтэһээ хубаагдал руу шэлжэхэнь гемопоэтик үүдэл эсэй (HSC) эдэбхижүүлгэдэ шухала, харин митохондриин хубаариие даралга HSC апоптоздо хүргэдэг [49]. Тиимэһээ манай дүнгүүд TGF-β1 эмшэлгэ эдэбхижүүлһэн гемопоэтическэ үүдэл эсүүдтэй (HSCs) холбоотой митохондриин хубаагдалда илүү түгээмэл байдаг һалбариин бууралгатай хамта митохондриин сүлжээнэй комплексно бууралтые үүсхэжэ магадгүй гэжэ харуулна. Үшөө тиихэдэ, манай мэдээнүүд IPA митохондриин хубиие бүмбэрсэг хэлбэриһээ дунда зэргын хэлбэридэ хубилгажа, тиигэжэ OPA1 ба MFN2-эй илгаралые багадхажа шададаг гэжэ харуулаа. OPA1-эй доошоо зохисуулга митохондриин мембранай потенциалые бууруулжа, эсэй апоптозые үүсхэхэ аргатай гэжэ шэнжэлэлнүүд харуулһан байна[50]. MFN2 митохондриин ниилэлтэ ба апоптозые зууршалдаг гэжэ мэдээжэ[51]. Олдоһон дүнгүүд TGF-β1 ба/гү, али IPA-гаар LX-2 эсэй индукци митохондриин хэлбэри ба хэмжээ, мүн эдэбхижүүлгын байдал ба сүлжээнэй орёо байдалые хубилдаг гэжэ тэмдэглэнэ.
Манай дүнгүүд TGFβ-1 ба IPA-гай хос эмшэлгэ апоптозһоо зайлаха эсүүдтэ фиброз, апоптоз ба амидаралтай холбоотой генүүдэй мРНК-гай илгаралые зохисуулха замаар mtDNA ба эсэй морфологиин үзүүлэлтые багадхажа шадаха гэжэ харуулна. Үнэхөөрөөшье, IPA AKT1 болон COL1A2 ба MMP2 гэхэ мэтэ фиброзой шухала генүүдэй мРНК-гай илгаралгын хэмжээе бууруулжа, харин апоптозтой холбоотой CASP8-ай илгаралгын хэмжээе нэмэгдүүлһэн байна. Манай дүнгүүдээр IPA эмшэлгын һүүлдэ BAX илгарал бууража, TIMP1 бүлэгэй дэд нэгэдэлнүүдэй, BCL-2 ба NF-κB-эй мРНК-гай илгарал нэмэгдэһэн байна, энэнь IPA апоптозһоо зайладаг гемопоэтик үндэһэн эсүүдтэ (HSCs) амидаралай дохёо эдэбхижүүлжэ шадаха гэжэ тэмдэглэнэ. Эдэ молекуланууд эдэбхижүүлһэн гемопоэтик үүдэл эсүүдтэ амидаралай дэмжэлгын дохёо боложо магадгүй, энэнь апоптотикын эсрэг уурагуудай (жэшээнь Bcl-2) илгарал нэмэгдэһэн, апоптозой эсрэг BAX-эй илгарал буурһан, TIMP ба NF-κB хоорондын комплексно харилсан үйлэшэлэлгэтэй холбоотой байжа болоно [5, 7]. IPA PXR-ээр дамжуулан нүлөө үзүүлдэг ба TGF-β1 ба IPA-тай хослуулан эмшэлгэ PXR мРНК-гай илгаралгын хэмжээе нэмэгдүүлһэниинь HSC-эй эдэбхижүүлгэ дарагдаһаниие харуулна гэжэ бидэ олообди. Идэбхижүүлһэн PXR дохёо дамжуулга HSC эдэбхижүүлгые in vivo болон in vitro хоерто дараха гэжэ мэдээжэ [52, 53]. Манай дүнгүүдэй ёһоор, IPA апоптозые дэмжэжэ, фиброз ба митохондриин бодосой солилсоое багадхажа, амидарха дохионуудые дээшэлүүлжэ, эдэбхижүүлһэн HSC-эй фенотипые эдэбхигүй болгодог еһотой үйлэ ябасанууд болохо эдэбхижүүлһэн HSC-эй сэбэрлэлгэдэ хабаадаха аргатай. Апоптоздо IPA-гай боломжотой механизм ба үүргэ тухай үшөө нэгэ тайлбаринь гэхэдэ, энэнь гол түлэб митофагии (дотоодо зам) ба NF-κB амидаралай дохёо дамжуулха замтай шууд холбоотой гадаада TNF дохёо дамжуулха замаар (Хүснэгтэ 1) дамжан үйлэ ажаллалгын алдагдалтай митохондриие арилгадаг (Нэмэлтэ Зураг 7). Һонирхолтойнь гэхэдэ, IPA-тай холбоотой баяжуулһан генүүд апоптозой замда про-апоптотик ба про-амидаралай дохионуудые үүсхэхэ шадалтай [54], энэнь IPA эдэ генүүдтэй харилсан үйлэшэлжэ апоптозой замые гү, али амидаралые үүсхэжэ магадгүй гэжэ тэмдэглэнэ. Гэбэшье, HSC эдэбхижүүлгын үедэ IPA апоптоз гү, али амидаралые яажа үүсхэнэ, тэрэнэй механизмын замууд тодорхой бэшэ байна.
IPA хадаа гэдэһэнэй микробиотоор дамжуулан хоол хүнэһэнэй триптофанһаа бии болоһон микробуудай метаболит юм. Шэнжэлэлнүүдэй дүнгөөр ​​энэнь гэдэһэнэй оршондо үрэһэлэй эсрэг, антиоксидант, эпигенетикын зохисуулха шанартай гэжэ элирүүлһэн байна.[55] IPA гэдэһэнэй хаалта үйлэ ажаллалгые хубилжа, исэлдэлтын стрессые багадхажа шададаг гэжэ шэнжэлэлнүүд харуулһан, энэнь тэрэнэй нютагай физиологиин нүлөөдэ хубита оруулдаг.[56] Үнэндөө, IPA эргэлтын замаар зорилготой эрхэтэнүүдтэ дамжуулагдадаг ба IPA триптофан, серотонин, индолой гаралтай адли гол метаболит бүтэсэтэй тула IPA бодосой солилсооной үйлэ ажалалгаа ябуулжа, үрэ дүнтэй бодосой солилсооной хуби заяа үрэ дүнтэй байдаг.[52] IPA ферментүүд гү, али рецепторнууд дээрэ холбохо газарнуудай түлөө триптофанһаа гаралтай метаболитуудтай тэмсэжэ магадгүй, энэнь хэб маягай бодосой солилсооной замые таһалха магадлалтай. Энэнь эмнэлгын сонхоёо һайнаар ойлгохын тулада тэрэнэй фармакокинетикэ ба фармакодинамикын талаар саашадаа шэнжэлэл хэхэ хэрэгтэй гэжэ онсолно.[57] Энэнь гемопоэтик үүдэл эсүүдтэ (HSCs) баһа боложо магадгүй гү гэжэ харагдахаар байна.
Манай шэнжэлэлгын зарим хизаарлалтанууд бии гэжэ бидэ зүбшөөнэбди. IPA-тай холбоотой холбоонуудые тусхайтаар шэнжэлхын тулада бидэ 2-дохи түхэлэй сахарна диабеттэй (T2DM) үбшэнтэниие хаһаһан байнабди. Энэнь манай ололтые 2-дохи түхэлэй сахарна диабеттай ба элэгэй үбшэнтэй үбшэнтэндэ үргэн хэрэглэхэ боломжые хизаарладаг гэжэ бидэ зүбшөөнэбди. Хүнэй һүндэ IPA-гай физиологиин концентраци 1–10 мкМ [11, 20] байгаашье һаа, 1 мМ IPA-гай концентраци эгээн ехэ хорото бэшэ концентраци [15] ба эгээн ехэ апоптозын хурдадхал дээрэ үндэһэлэн шэлэгдэһэн, энэнь үхэлэй эсэй популяциин хубида илгаагүй. Энэ шэнжэлэлгын үедэ IPA-гай супрафизиологическа хэмжээнүүдые хэрэглэһэншье һаа, IPA-гай үрэ дүнтэй тун тухай мүнөөдэр зүбшэл үгы [52]. Манай дүнгүүд удха шанартайшье һаа, IPA-гай үргэн бодосой солилсооной хуби заяан шэнжэлэлгын эдэбхитэй һалбари болоод байна. Үшөө тиихэдэ, һүнэй IPA хэмжээн ба элэгэй транскриптын ДНХ-эй метилированиин хоорондохи холбоон тухай манай ололтые ганса гемопоэтик үүдэл эсүүдһээ (HSCs) бэшэ, харин элэгэй эдһээ абаһан байна. Бидэ хүнэй LX-2 эсые хэрэглэхэеэ шэлэһэн байнабди, юундэб гэхэдэ IPA гемопоэтик үүдэл эсэй (HSC) эдэбхижүүлгэтэй холбоотой [15], HSCs элэгэй фиброзой хүгжэлтэдэ хабаатай гол эсүүд юм. Элэг олон эсэй түхэлнүүдһээ бүридэнэ, тиимэһээ IPA-гай үүргэ болон бусад элэгэй эсэй түхэлнүүдтэй харилсан үйлэшэлэлгэ шэнжэлхын тулада гепатоцит-HSC-иммун эсэй хамтын үрэжүүлгын системэ, каспазын эдэбхижүүлгэ ба ДНХ-эй хубаагдал, мүн уураг түбшэниие багтааһан үйлэшэлэлэй механизм гэхэ мэтэ бусад эсэй загбарнуудые абажа үзэхэ хэрэгтэй.