Мүнөөнэй *Мүнөөнэй хаяг: Кельн 50931, Германи, Кёльн Хүгшэрхэтэй холбоотой үбшэнүүдтэ эсэй стрессэй харюугай эрхим кластерай шэнжэлэлгэ (CECAD).
Митохондриин үбшэнүүдэй нейродегенераци һэргээгдэхэгүй гэжэ үзэдэг, юундэб гэхэдэ нейронуудай бодосой солилсооной уян хатан байдал хизаарлагдамал байдаг, харин митохондриин үйлэ ажаллалгын алдагдалай бэеын нейронуудай бодосой солилсооной эсэй автономидо үзүүлхэ нүлөөнь муугаар ойлгогдодог. Эндэ бидэ митохондриин синтезэй динамикын таһарһанһаа боложо OXPHOS-эй дэбжэлтэтэй дутагдалтай Пуркинье нейронуудай эсэй тусхай протеомые нэбтэрүүлнэбди. Митохондриин үйлэ ажаллалгын алдагдалынь протеомикын һалбарида гүнзэгы хубилалта үүсхэһэн гэжэ бидэ олообди, энэнь эгээ һүүлдэ эсэй үхэлэй урда нарин бодосой солилсооной программын дараалан эдэбхижүүлгэдэ хүргэбэ. Хүлеэгдээгүйгөөр, бидэ пируват карбоксилаза (PCx) болон бусад хүгшэрхэ эсэргүү ферментүүдэй эли тодо үүсхэлые тодорхойлбобди, тэдэ TCA циклэй дундажа зүйлнүүдые нэмэлтэ болгоно. PCx-эй даралга исэлдэлтын стресс ба нейродегенерациие улам шангадхадаг, энэнь атеросклероз OXPHOS дутагдалтай нейронуудта хамгаалха нүлөөтэй гэжэ харуулна. Һүүлшын үедэ доройтоһон нейронуудта митохондриин ниилэлтые һэргээхэ нь эдэ бодосой солилсооной шэнжэ шанарые бүримүһэн һэлгэжэ, тиигэжэ эсэй үхэлые һэргылнэ. Манай ололтонь митохондриин үйлэ ажаллалгын алдагдалда уян хатан байдалые үгэдэг урид мэдэгдээгүй замуудые элирүүлжэ, үбшэнэй һүүлшын шатадашье нейродегенераци һэргээгдэхэ аргатай гэжэ харуулна.
Нейроной энергиин солилсоое хадгалхада митохондриин гол үүргэ хүнэй митохондриин үбшэнтэй холбоотой үргэн мэдрэлийн шэнжэ тэмдэгүүдээр онсологдоно. Эдэ үбшэнүүдэй ехэнхинь митохондриин генэй илгаралые зохисуулдаг генэй мутациһаа (1, 2) гү, али митохондриин динамикатай холбоотой генэй үгы бололгоһоо үүдэлтэй, энэнь митохондриин ДНХ-эй (mtDNA) тогтвортой байдалда шууд бэшэ нүлөө үзүүлдэг (3, 4). Амитадай загбар дээрэ хэһэн ажал оршон тойронхи эдэй митохондриин үйлэ ажаллалгын алдагдахада харюусахын тулада консерватив бодосой солилсооной замуудые (5-7) эдэбхижүүлжэ болохо гэжэ харуулһан болоод энэнь эдэ комплексно үбшэнүүдэй эмгэг үүсхэлые гүнзэгыгөөр ойлгоходо шухала мэдээсэл үгэнэ. Харин тархиин митохондриин аденозинтрифосфат (АТФ) үйлэдбэрилэлэй ниитэ алдагдалда үүсхэдэг тусхай эсэй түрэлнүүдэй бодосой солилсооной хубилалтанууд тухай манай ойлголто үндэһэн (8), үбшэнһөө һэргылхэ гү, али һэргылхэ хэрэгсэл болохо эмнэлгын зорилгонуудые элирүүлхэ хэрэгтэй гэжэ онсолно. Нейродегенерациһаа һэргылхэ (9). Мэдээсэлэй дутагдал хадаа мэдрэлийн эсүүдые оршон тойронхи эдэй эсэй түхэлнүүдтэй харисуулхада тон хизаарлагдамал бодосой солилсооной уян хатан гэжэ үргэнөөр үзэдэг ушарһаа болоно (10). Эдэ эсүүд синаптик дамжуулалтые дэмжэхэ ба гэмтэл ба үбшэнэй байдалда харюусахын тулада нейронуудта метаболит хангамжые зохисуулха гол үүргэ гүйсэдхэдэг тула тархиин эдэй хүндэ байдалда эсэй бодосой солилсоо дабшаха шадабаринь глиал эсүүдтэ бараг хизаарлагдадаг (11-14). Нэмэжэ хэлэхэдэ, тархиин эдэй үндэһэн эсэй гетерогенность тусхай нейронуудай дэд бүлэгүүдтэ болодог бодосой солилсооной хубилалтануудые шудалхада ехэ һаад ушаруулдаг. Тэрэнэй үрэ дүндэ нейронуудай митохондриин үйлэ ажаллалгын алдагдаха эсэй ба бодосой хубилалтын үрэ дүн тухай бага мэдээжэ.
Митохондриин үйлэ ажаллалгын алдагдалай бодосой солилсооной үрэ дүн ойлгохын тулада бидэ митохондриин гадаада мембранай ниилэлтэ (Mfn2) үгы болоһонһоо үүдэһэн нейродегенерациин элдэб шатада байһан Пуркинье нейронуудые (PNs) тусгаарлаабди. Хүнэй Mfn2 мутацинь Charcot-Marie-Tooth type 2A (15) гэжэ нэрлэгдэһэн удамшалай мотор мэдрэлэй нейропатиин хэлбэритэй холбоотойшье һаа, хулганануудта Mfn2-эй ушартай үгы бололго хадаа исэлдэлтын фосфорилированиин (OXPHOS) дисфункциин арга үүсхэл гэжэ һайн танигдаһан байна. Элдэб янзын нейронуудай дэд түхэлнүүд (16-19) ба үрэ дүндэ гараһан нейродегенеративна фенотип хүдэлөөнэй эмгэгүүд (18, 19) гү, али тархиин атакси (16) гэхэ мэтэ дэбжэлтын мэдрэлийн шэнжэ тэмдэгүүдтэй хамта байдаг. Тэмдэггүй тоогой (LFQ) протеомикын, метаболомикын, дүрсэлэлгын болон вирусологиин аргануудые хослуулан хэрэглэжэ, бидэ дэбжэлтын нейродегенераци пируват карбоксилаза (PCx) болон PN-эй артериосклероздо хабаатай бусад хүшэлтүрэгшэдые in vivo Ферментнүүдэй илгаралда ехээр үүсхэнэ гэжэ харуулнабди. Энэ ололтонь үнэн зүб байһые шалгахын тулада бидэ Mfn2-дутагдалтай PN-үүдтэ PCx-эй илгаралые тусхайтаар доошолуулжа, энэ үйлэ ажалалгаа исэлдэлтын стрессые улам хүндэрүүлжэ, нейродегенерациие түргэдүүлдэг гэжэ элирүүлээбди, тиигэжэ азоосперми эсэй үхэл үгэдэг гэжэ гэршэлбэбди. MFN2-эй хүндэ илгарал OXPHOS-эй хүндэ дутагдалтай, митохондриин ДНХ-эй ехэ хэрэглээтэй, митохондриин сүлжээнэй таһарһан шэнжэтэй түгэсхэлэй үрэ дүнгүй болоһон PN-ые бүримүһэн абарха аргатай, энэнь нейродегенерациин энэ түхэл эсэй үхэлэй урда үбшэнэй дэбжэһэн шатадашье һэргэжэ болохо гэжэ улам онсолон тэмдэглэнэ.
Mfn2 нокаут PN-үүдэй митохондриие харуулхын тулада бидэ Cre-дулдыданги митохондриие шара флуоресцентнэ уураг (YFP) (mtYFP) (20) Cre илгаралые зорюулха боломжо олгодог хулгана штаммые хэрэглэжэ, митохондриин морфологиие in vivo шалгабабди. PN-дэхи Mfn2 генэй үгы болохонь митохондриин сүлжээнэй аажамаар хубаагдахада хүргэхэ гэжэ бидэ олообди (Зураг S1A), эгээл эртын хубилалта 3 долоон хоногой наһандаа олоһон байна. Харин PN эсэй дабхаргын үндэр хэмжээнэй доройтол, энэнь Калбиндинай иммунобудалга алдагдахаһаа гэршэлэгдэнэ, 12 долоон хоногой наһа хүрэтэр эхилээгүй (Зураг 1, А ба В). Митохондриин морфологиин эгээн эртын хубилалтанууд болон нейронуудай үхэлэй харагдаха эхилэлэй хоорондохи сагай тааралдалгүй байдал бидэниие эсэй үхэлэй урда митохондриин үйлэ ажаллалгын алдагдахаһаа үүдэһэн бодосой солилсооной хубилалтануудые шэнжэлхэ зорилготойгоор уряалаа. Бидэ YFP (YFP+)-илгаруулдаг PN (Зураг 1С) болон хяналтын хулганануудта (Mfn2 + / loxP :: mtYFP loxP- stop-loxP: : L7-cre) тусгаарлаха флуоресценциин эдэбхижүүлһэн эсэй илгарал (FACS) дээрэ үндэһэлһэн стратеги зохёогообди, саашадаа CTRL (Зураг S1B) гэжэ нэрлэгдэхэ. YFP дохёоной харисангы эршэм хүсэндэ үндэһэлһэн үүдэнэй стратегиин оновчтой болгохо гээшэ PN-эй YFP+ бэеые (YFPhigh) PN-һээ (YFPneg) (Зураг S1B) гү, али таамаглаһан флуоресцентнэ аксон/дендрит фрагментнуудһаа (YFPlow; Зураг S1D, зүүн) сэбэрлэхэ боломжо олгоно, энэнь конфокальна микроскопоор баталагданхай (Зураг S1D, баруун). Ангилагдаһан популяциин үндэһэ һууриие шалгахын тулада бидэ LFQ протеомикые, удаань гол бүридүүлэгшын шэнжэлэл хэжэ, YFPhigh ба YFPneg эсүүдэй хоорондо тодорхой илгарал бии гэжэ элирүүлээбди (Зураг S1C). YFPhigh эсүүд мэдээжэ PNs тэмдэглэгшэдэй (жэшээнь Calb1, Pcp2, Grid2 ба Itpr3) сэбэр баяжуулга харуулһан (21, 22), харин нейронуудта гү, али бусад эсэй түхэлнүүдтэ ниитэдээ илгаруулагдадаг уурагуудай баяжуулга үгы (Зураг 1D) ). Бэеэ дааһан туршалгануудта суглуулагдаһан ангилагдаһан YFPhigh эсүүдэй дээжэнүүдэй хоорондохи зэргэсүүлгэ > 0.9 корреляциин коэффициент харуулһан, энэнь биологическа дабталгануудай хоорондохи һайн дахин үржэхэ шадабариие харуулһан (Зураг S1E). Тобшолол хэхэдээ, эдэ мэдээнүүд бэелүүлэгдэхэ аргатай PN-эй хурдан ба тусхай тусгаарлалта тухай манай түсэбые баталаа. Хэрэглэгдэһэн L7-cre драйвер системэнь түрэһэнэй һүүлдэ түрүүшын долоон хоногто мозаикын рекомбинациие үүсхэнэ (23), бидэ CTRL-һээ хулганануудые һалгаажа эхилээбди ба ушартай (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre) нейронуудые суглуулха. Рекомбинаци дүүрэһэнэй удаа 4 долоон хоногой наһатайдаа Mfn2cKO гэжэ нэрэтэй. Түгэсхэлэй тэмдэг болгон, бидэ митохондриин эли тодо хубааритайшье һаа, PN дабхаргын бүтэн байхада 8 долоон хоногой наһа шэлээбди (Зураг 1B ба Зураг S1A). Бүхыдөө бидэ 3013 уураг тоолообди, тэдэнэй 22% оршом митохондриин протеомые митохондри гэжэ үндэһэлһэн MitoCarta 2.0 аннотацинууд дээрэ үндэһэлһэн байгаа (Зураг 1Е) (Зураг 1Е) (24). 8-дахи долоон хоногто хэгдэһэн дифференциальна генэй илгарал шэнжэлэлгын дүнгөөр ​​бүхы уурагуудай оройдоол 10.5%-нь удха шанартай хубилалтануудтай байгаа (Зураг 1F ба Зураг S1F), тэдэнэй 195 уурагууд доошоо зохисуулагдаһан, 120 уурагууд дээшээ зохисуулагдаһан (Зураг 1F). Энэ мэдээсэлэй багтаамжын “шэнэ зам шэнжэлэл” илгаатайгаар илгаруулагдаһан генүүд гол түлэб тусхай бодосой солилсооной замуудай хизаарлагдамал багта хамаардаг гэжэ тэмдэглэхэ шухала (Зураг 1G). Һонирхолтойнь гэхэдэ, OXPHOS болон кальциин дохёо дамжуулхатай холбоотой замуудай доошоо зохисуулга синтез дутагдалтай PN-үүдтэ митохондриин үйлэ ажаллалгын алдагдалые үүсхэһэниие баталдагшье һаа, гол түлэб аминохүшэлэй солилсоондо хабаатай бусад ангилалнууд нилээд дээшэлүүлэгдэдэг, энэнь митохондриин PN-дэ болодог бодосой солилсоотой тааруу байна. һандарал.
(A) CTRL ба Mfn2cKO хулганануудай тархиин хэһэгүүдэй түлөөлһэн конфокальна гэрэл зурагууд PN-эй үргэлжэлһэн алдагдалые харуулна (calbindin, саарал); голнуудые DAPI-ээр будажа абаһан байна. (B) (A)-гай тоосоолол (дисперсиин нэгэ тээшээ шэнжэлэл, ***P<0.001; гурбан хулганаһаа n = 4-һөө 6 хүрэтэр дүхэригүүд). (C) Туршалгын ажалай ябаса. (D) Пуркинже (дээдэ) болон бусад эсэй түхэлнүүдтэ (дунда) тусхай тэмдэглэгшэдэй дулаанай карта хубаари. (E) Ангилагдаһан PN-дэ элирүүлэгдэһэн митохондриин уурагуудай тоо харуулһан Веннэй диаграмма. (F) 8 долоон хоногто Mfn2cKO нейронуудта илгарал илгаруулагдаһан уурагуудай вулканай зураг (1.3-ай удха шанартай огтолһон сэн). (G) Зохёохы замые шэнжэлэлгэ 8 долоон хоног гэжэ ангилагдаһан Mfn2cKO PN-дэ эгээл шухала табан дээшээ зохисуулха (улаан) ба доошоо зохисуулха (хүхэ) замые харуулна. Илгарһан уураг бүхэнэй дунда зэргын илгарал харуулагдана. Саарал үнгэтэй дулаанай карта: тааруулһан P сэн. ns, шухала бэшэ.
Протеомикын мэдээнүүд I, III, IV комплексын уураг илгарал аажамаар буурһан байна. I, III, IV комплексууд бултадаа mtDNA-кодлогдоһон дэд нэгэдэлнүүдые агуулдаг, харин гансал ядерна кодлогдоһон II комплекс үндэһэндээ нүлөөлдэггүй (Зураг 2А ба Зураг S2A). . Протеомикын дүнгүүдтэй тааруугаар, тархиин эдэй хэһэгүүдэй иммуногистохимиин шэнжэлэлгээр PN-дэхи IV комплексын MTCO1 (митохондриин цитохром С оксидазын дэд нэгэдэл 1) дэд нэгэдэлэй хэмжээн аажамаар буурһан байна (Зураг 2В). mtDNA-кодлогдоһон Mtatp8 дэд нэгэдэл ехээр багадхаһан (Зураг S2A), харин ядро ​​кодлогдоһон ATP синтазын дэд нэгэдэлэй тогтомол байдалай хэмжээн хубилагдаагүй, энэнь mtDNA-гай илгарал тогтвортой байхада мэдээжэ тогтвортой ATP синтазын дэд суглуулбари F1 комплекстой тааруу байна. Бүтээлынь нягта. Таһалха (7). Бодото сагта полимеразын гинжэтэ урбалаар (qPCR) сортировалһан Mfn2cKO PN-үүдэй mtDNA-гай хэмжээе сэгнэхэдээ mtDNA-гай хуулбариин тоо аажамаар буурһаниие баталаа. Хяналтын бүлэгтэй харисуулхада, 8 долоон хоногой наһандаа мтДНК-гай хэмжээнэй оройдоол 20% үлэһэн байна (Зураг 2С). Эдэ дүнгүүдтэй тааруугаар, Mfn2cKO PN-эй конфокальна микроскопиин будалга ДНХ-ые элирүүлхын тулада хэрэглэгдэжэ, митохондриин нуклеотидуудай сагһаа дулдыдаха хэрэглээе харуулһан байна (Зураг 2D). Митохондриин уураг задарал ба стрессэй харюу үйлэдэлдэ хабаатай гансал зарим кандидатнууд, энэ тоодо Lonp1, Afg3l2 ба Clpx, ба OXPHOS комплексын суглуулбариин хүшэлтүрэгшэд дээшэлүүлэгдэһэн гэжэ бидэ олообди. Апоптоздо хабаатай уурагуудай хэмжээндэ удха шанартай хубилалтанууд элирүүлэгдээгүй (Зураг S2B). Үшөө тиихэдэ, кальциин дамжуулгада хабаатай митохондри болон эндоплазмын торлог һубагууд багахан хубилалтануудтай гэжэ бидэ олообди (Зураг S2C). Нэмэжэ хэлэхэдэ, аутофагитай холбоотой уурагуудые сэгнэхэдээ ямаршье удха шанартай хубилалта оложо шадаагүй, энэнь иммуногистохими болон электрон микроскопоор in vivo ажаглаһан аутофагосомуудай харагдаха индукцитай тааруу байна (Зураг S3). Гэбэшье, PN-дэхи OXPHOS-эй үргэлжэлһэн дисфункцинь эли тодо ультраструктурна митохондриин хубилалтануудтай хамта байдаг. ба 8 долоон хоногой наһатай Mfn2cKO PN-эй эсэй бэе ба дендрит мододто митохондриин һүрэгүүд харагдана, дотоодо мембранай бүтэсэ гүнзэгы хубилалтада ороһон байна (Зураг S4, А ба В). Эдэ ультраструктурна хубилалтанууд болон mtDNA-гай мэдэгдэхүйсэ бууралтатай тааруулан, тархиин хурц тархиин шэлбэнүүдые тетраметилродаминай метил эфиртэй (TMRM) шэнжэлхэдэ Mfn2cKO PN-үүдэй митохондриин мембранын потенциал мэдэгдэхүйсэ буурһан байна (Зураг S4C).
(A) OXPHOS комплексын илгаралгын хэмжээнэй саг хугасаанай шэнжэлэл. Гансал 8 долоон хоногто P<0.05 уурагуудые абажа үзэхэ (хоёр талаһаа ANOVA). Точкотой зурлаа: CTRL-тэй харисуулхада тааруулга үгы. (B) Зүүн: анти-MTCO1 эсэргүү бодосоор тэмдэглэгдэһэн тархиин хэһэгэй жэшээ (масштабай зурлаа, 20 мкм). Пуркинже эсэй бэенүүдэй эзэлдэг газар шара үнгөөр ​​хушаатай. Баруун тээ: MTCO1 хэмжээнэй тоосоолол (дисперсиин нэгэ талаһаа шэнжэлэл; гурбан хулганаһаа шэнжэлһэн n = 7-һоо 20 эс хүрэтэр). (C) mtDNA хуулбариин тоогой qPCR шэнжэлэл ангилагдаһан PN-дэ (дисперсиин нэгэ тээшээ шэнжэлэл; n = 3-һаа 7 хүрэтэр хулгана). (D) Зүүн: ДНХ-эй эсрэг эсэргүү бодосоор тэмдэглэгдэһэн тархиин хэһэгэй жэшээ (масштабай зурлаа, 20 мкм). Пуркинже эсэй бэенүүдэй эзэлдэг газар шара үнгөөр ​​хушаатай. Баруун тээ: мтДНХ-эй гэмтэлэй тоосоолол (дисперсиин нэгэ талаһаа шэнжэлэл; гурбан хулганаһаа n = 5-һаа 9 эс хүрэтэр). (E) Бүхы эсэй заһабариин зажим тэмдэглэлдэ mitoYFP + Purkinje эсүүдые (сум) харуулһан хурц тархиин хэһэгэй жэшээ. (F) IV мурые тодорхойлолго. (G) CTRL ба Mfn2cKO Пуркинье эсүүдтэ деполяризациин гүйдэлэй тарилгын түлөөлһэн тэмдэглэлнүүд. Дээдэ мүр: АП-ые үүсхэһэн түрүүшын импульс. Доодо мүр: AP-эй эгээн ехэ дабтамжа. (H) Постсинаптическа аяндаа ороһон оролтые (sPSPs) тодорхойлолго. Түлөөлэгшэ тэмдэглэлэй мүр ба тэрэнэй томошуулха харисаа (I)-дэ харуулагдана. Дисперсиин нэгэ тээшээ шэнжэлэл гурбан хулганаһаа n = 5-һаа 20 хүрэтэр эсүүдые шэнжэлһэн байна. Мэдээллые дунда зэргын±SEM гэжэ харуулна; *Р<0.05; **Р<0.01; ***P<0.001. (J) Нүхэтэй заһабариин зажим горим хэрэглэн тэмдэглэгдэһэн аяндаа AP-эй түлөөлһэн мүрнүүд. Дээдэ мүр: AP-эй эгээн ехэ дабтамжа. Доодо мүр: нэгэ AP-ые томо болгохо. (K) (J) ёһоор дунда зэргын ба дээдын AP дабтамжые тодорхойлхо. Манн-Уитниин туршалга; n = 5 эсүүдые дүрбэн хулганаһаа шэнжэлһэн байна. Мэдээллые дунда зэргын±SEM гэжэ харуулна; шухала бэшэ.
долоон хоногой Mfn2cKO PN-дэ OXPHOS-эй эли тодо гэмтэл элирүүлэгдэһэн, энэнь нейронуудай физиологическа үйлэ ажалалгаа ехээр гажуудалтай байһые харуулна. Тиимэһээ бидэ 4-5 долоон хоногто ба 7-8 долоон хоногто OXPHOS-дутагдалтай нейронуудай идэвхгүй сахилгаан шэнжэ шанарые хурц тархиин шэлбэнүүдтэ бүхэли эсэй заһабариин зажим тэмдэглэлнүүдые хэжэ шэнжэлээбди (Зураг 2Е). Хүлеэгдээгүйгөөр, Mfn2cKO нейронуудай дунда зэргын амаралтада байһан мембранай потенциал ба оролто эсэргүүсэл хяналтынхитай адли байгаа, зүгөөр эсүүдэй хоорондо нарин илгаанууд байгаа (Хүснэгтэ 1). Үшөө тиихэдэ 4-һөө 5 долоон хоногой наһанда гүйдэл-хүшэлтүрэгшын харилсаанда (IV муруй) удха шанартай хубилалтанууд олоогдоогүй (Зураг 2F). Гэбэшье, 7-һоо 8 долоон хоногой Mfn2cKO нейронууд IV дэглэм (гиперполяризациин алхам) дабажа шадаагүй, энэнь энэ һүүлшын шатада гиперполяризациин боломжодо тодорхой мэдрэмжэтэй байһые харуулна. Харин Mfn2cKO нейронуудта дабтагдадаг үйлэ ажаллалгын потенциал (AP) гаргалгые үүсхэхэ деполяризациин гүйдэл һайнаар тэсэбэритэй байдаг, энэнь тэдэнэй ниитэ гаргалгын хэб маяг 8 долоон хоногой хяналтын нейронуудһаа илгаатай бэшэ гэжэ харуулна (Хүснэгтэ 1 ба Зураг 2G). Үшөө тиихэдэ, өөрынгөө дураар постсинаптическа гүйдэлэй (sPSCs) дабтамжа ба дабтамжа хяналтын бүлэгтэй адли байгаа, тиигээд үйлэ ябадалай дабтамжа 4 долоон хоногһоо 5 долоон хоног хүрэтэр 7 долоон хоногһоо 8 долоон хоног хүрэтэр адли нэмэгдэлтэйгээр нэмэгдэһэн байна (Зураг 2, H ба I). PN-үүдэй синаптик болбосоролой үе (25). Нүхэтэй PNs заһабарилгын һүүлдэ адли дүнгүүд абтаһан байна. Энэ тохиргоо бүхэли эсэй заһабариин зажим бүридхэлдэ боложо магадгүй эсэй АТФ-эй гажигуудые нэхэмжэлхэһээ сэргийлнэ. Тодорхойгоор хэлэбэл, Mfn2cKO нейронуудай амаралтада байһан мембранай потенциал ба аяндаа буудалгын дабтамжа нүлөөлөөгүй (Зураг 2, J ба K). Тобшолол хэхэдээ, эдэ дүнгүүд OXPHOS-эй эли тодо дисфункцитай PN-үүд үндэр дабтамжын гаргалгын хэб маягые һайнаар дабажа шададаг гэжэ харуулна, энэнь тэдэндэ ойролсоогоор хэб маягай электрофизиологическа харюунуудые хадгалха боломжо олгодог компенсациин механизм бии гэжэ харуулна.
Мэдээллые дунда зэргын ± SEM (дисперсиин нэгэ тээшээ шэнжэлэл, Холм-Сидагай олон зэргэсүүлгын туршалга; *P<0.05) гэжэ харуулна. Нэгэдэлэй дугаар хаалта соо харуулагдана.
Бидэ протеомикын мэдээсэлэй багта ямар нэгэн ангилал (Зураг 1G) OXPHOS-эй хүндэ дутагдалтай тэмсэхэ замуудые багтаадаг гү гэжэ шэнжэлхэеэ шиидэбэбди, тиигэжэ нүлөөлһэн PN яагаад ойролсоогоор хэб маягай электрофизиологиие хадгалжа шададагые тайлбарилбабди (Зураг 2, E-һээ K хүрэтэр). . Протеомикын шэнжэлэлгын дүнгөөр ​​һалаа гинжын аминохүшэлэй (BCAA) катаболизмда хабаатай ферментнүүд ехээр дээшэлүүлэгдэһэн байна (Зураг 3А ба Зураг S5A), тиигээд һүүлшын бүтээгдэхүүн ацетил-КоА (КоА) гү, али сукцинил КоА артериосклерозой хүшэлтүрэгшын (TCA) циклэй трикарбоксилатуудые нэмэлтэ болгон хэрэглэжэ болоно. BCAA трансаминаза 1 (BCAT1) ба BCAT2 хоюулаа нэмэгдэһэн гэжэ бидэ олообди. Тэдэ α-кетоглутаратһаа глутамат бии болгожо BCAA катаболизмын түрүүшын алхамые катализировална (26). Салбарһан гинжын кето хүшэлтүрэгшын дегидрогеназа (BCKD) комплексые бүридүүлдэг бүхы дэд нэгэдэлнүүд дээшээ зохисуулагдадаг (комплекс үүсэһэн BCAA нүүрһэнтүрэгшын араг яһанай удаадахи ба бусаагдашагүй декарбоксилированиие катализировална) (Зураг 3А ба Зураг S5A). Гэбэшье, BCAA-гай өөрөө илгарма хубилалтанууд ангилагдаһан PN-дэ оложо шадаагүй, энэнь эдэ шухала аминохүшэлнүүдэй эсэй абалга нэмэгдэһэнһээ гү, али TCA циклые нэмэлтэ болгон бусад эхи үүсэбэри (глюкоза гү, али һүнэй хүшэлтүрэгшэ) хэрэглэһэнһээ боложо магадгүй (Зураг S5B). OXPHOS дутагдалтай PN-үүд 8 долоон хоногой наһандаа глутамин задарал ба трансаминациин үйлэ ажалалгаа нэмэгдэһэн байна, энэнь митохондриин фермент глутаминаза (GLS) ба глутамин пируват трансаминаза 2 (GPT2)-эй дээшэлүүлгэгээр харуулагдана (Зураг 3, А ба С). GLS-эй дээдэ зохисуулга сплайсированна изоформ глутаминаза С (GLS-GAC)-ээр хизаарлагдадаг (Mfn2cKO/CTRL-эй хубилалта ойролсоогоор 4.5 дахин ехэ, P = 0.05), хорото хабдарай эд эстэ тэрэнэй тусхай дээшэлүүлгэ митохондриин биоэнергиие дэмжэхэ аргатай гэжэ тэмдэглэхэ шухала. (27).
(A) Дулаанай карта 8 долоон хоногто тодорхойлогдоһон замаар уураг хэмжээнэй хубилалтые харуулна. (B) Анти-PCx эсэргүү бодосоор тэмдэглэгдэһэн тархиин хэһэгэй жэшээ (масштабай зурлаа, 20 мкм). Шара һумаар Пуркинье эсэй бэе руу заана. (C) Атеросклерозой шухала кандидат гэжэ тодорхойлогдоһон уураг илгаралгын шэнжэлэл (олон t-тест, *FDR <5%; n = 3-5 хулгана). (D) Дээдэ: [1-13C]пируват мүрдэлгэ соохи тэмдэглэгдэһэн нүүрһэнтүрэгшын орохо элдэб аргануудые харуулһан схемэтэ диаграмма (жэшээнь, PDH гү, али транс-артериальна замаар). Доодо: Скрипкын диаграммада [1-13C]пируватаар хурц тархиин шэлбэнүүдые тэмдэглэһэнэй удаа аспартанай хүшэлтүрэгшэ, лимоной хүшэлтүрэгшэ ба яблочно хүшэлтүрэгшэ болгон хубилһан нэгэ тэмдэгтэй нүүрһэнтүрэгшын (M1) хубиие харуулна (хос t-шалгалта; ** P <0.01). (Е) Зааһан замые саг хугасаанай түүхын үргэн шэнжэлэл. Гансал 8 долоон хоногто P<0.05 уурагуудые абажа үзэхэ хэрэгтэй. Таһархай зурлаа: тааруулгын сэнгүй (дисперсиин хоёр талаһаа шэнжэлэл; * P <0.05; *** P <0.001). Мэдээллые дунда зэргын±SEM гэжэ харуулна.
Манай шэнжэлэлгын дүнгөөр, BCAA катаболизм гол дэбжүүлгын замуудай нэгэн болоһон байна. Энэ баримта OXPHOS дутагдалтай PN-дэ TCA циклдэ орожо байһан агааржуулгын хэмжээн хубилжа магадгүй гэжэ бата бэхеэр тэмдэглэнэ. Энэнь нейронуудай бодосой хубилалтын гол түхэл боложо магадгүй, энэнь хүндэ OXPHOS-ай үйлэ ажаллалгын үедэ нейронуудай физиологи болон амидаралда шууд нүлөө үзүүлжэ магадгүй. Энэ таамаглалай ёһоор, бидэ гол атеросклерозой эсрэг фермент PCx дээшээ зохисуулагдадаг (Mfn2cKO/CTRL ойролсоогоор 1.5 дахин хубилдаг; Зураг 3А), энэнь пируватые оксалоацетат болгохо катализатор болгодог (28), энэнь тархиин эд эстэ илгарал астроцитуудта хизаарлагдадаг гэжэ үзэдэг (29, 30). Протеомикын дүнгүүдтэй тааруугаар, конфокальна микроскопоор PCx-эй илгарал OXPHOS-дутагдалтай PN-үүдтэ тусхайтаар ба мэдэгдэхүйсэ нэмэгдэһэн, харин PCx-эй реактивность гол түлэб хяналтын зэргэлээд байһан Бергманнай глиал эсүүдтэ хизаарлагдаһан байгаа (Зураг 3В). PCx-эй ажаглагдаһан үргэдхэлые функциональна аргаар туршахын тулада бидэ хурса тархиин шэлбэнүүдые [1-13C]пируват мүрдэлгын аргаар эмшэлһэн байнабди. Пируватые пируватдегидрогеназаар (PDH) исэлдүүлхэдэнь, тэрэнэй изотопой тэмдэг үгы болодог, харин пируват судасай урбалаар солилсоходо TCA циклэй дундажа зүйлнүүдтэ ородог (Зураг 3D). Манай протеомикын мэдээсэлые дэмжэжэ, бидэ Mfn2cKO шэлбэнүүдэй аспартанай хүшэлтүрэгшэдэ энэ мүрдэлгын олон тооной тэмдэглэгшэдые ажаглаабди, харин лимоной хүшэлтүрэгшэ ба яблочно хүшэлтүрэгшэ мүн лэ дунда зэргын хандалгатай байгаа, гэбэшье удха шанаргүй (Зураг 3D).
Дофамин нейронуудай митохондриин транскрипциин фактор А ген (Tfam) тусхайтаар үгы хэһэнһээ боложо митохондриин үйлэ ажаллалгын алдагдалтай MitoPark хулганануудай дофамин нейронуудта (Зураг S6B) PCx илгарал мүн лэ мэдэгдэхүйсэ дээшээ зохисуулагдаһан (31), энэнь ацетоной хүшэлтүрэгшын артериосклерозой бии бололго нейронуудай үйлэ ажаллалгын алдагдалтай үедэ зохисуулагдадаг гэжэ харуулна Бэе соохи ОКСФОС. Артериосклерозтой холбоотой байжа болохо нейронуудта илгаруулагдажа болохо онсогой ферментнүүд (32-34) OXPHOS дутагдалтай PN-үүдтэ үндэр хэмжээндэ зохисуулагдадаг гэжэ элирүүлһэн байна, жэшээнь пропионил-КоА карбоксилаза (PCC-A), Малонил-КоА пропионил-КоА карбоксилаза ба сукцинолхондриальна малонил А фермент 3 (ME3), гол үүргэнь малатһаа пируват һэргээхэ (Зураг 3, А ба С) (33, 35). Нэмэжэ хэлэхэдэ, бидэ Pdk3 ферментэй үндэр нэмэгдэл олообди, энэнь PDH-ые фосфорилировалжа, тиигэжэ эдэбхигүй болгодог (36), харин PDH-ые эдэбхижүүлдэг Pdp1 ферментдэ гү, али PDH ферментэй комплекс өөрөө ямаршье хубилалта элирүүлэгдээгүй (Зураг 3А). Mern2cKO PN-үүдтэ Ser293-дахи PDH комплексын пируват дегидрогеназа E1 компонентын α1 дэд нэгэдэлэй α (PDHE1α) дэд нэгэдэлэй фосфорилировани (PDH-эй ферментын үйлэ ажаллалгые дараха гэжэ мэдээжэ) нэмэгдэһэн байна (Зураг S6C) (Зураг S6C). Пируват һудаһанай нэбтэрэлгэгүй.
Һүүлдэнь, эдэбхижүүлгын үйлэ ябасада мэдээсэлэй ёһоор, серин ба глицинэй биосинтезэй супер зам, холбоотой митохондриин фолат (1С) цикл ба пролин биосинтез (Зураг 1G ба Зураг S5C) эдэбхижүүлгын үйлэ ябасада мэдээсэһээр үндэр хэмжээндэ зохисуулагдадаг гэжэ олообди. Оршон тойронхи эдүүд митохондриин үйлэ ажаллалгын алдагдалда эдэбхижүүлэгдэнэ (5-7). Эдэ протеомикын мэдээнүүдые дэмжэһэн конфокальна шэнжэлэл OXPHOS үгытэй PN-дэ 8 долоон хоногой хулганануудай тархиин шэлбэнүүдые митохондриин фолатын циклэй гол фермент болохо серин гидроксиметилтрансфераза 2 (SHMT2)-да оруулһан байна. Дархалалай удха шанартай харюу (Зураг S5D). CU-глюкозоор инкубацилагдаһан хурц тархиин шэлбэнүүдтэ бодосой солилсооной мүрдэлгын туршалганууд серин ба пролин биосинтезэй дээшэлүүлһэн зохисуулгые улам баталһан, энэнь нүүрһэнтүрэгшын изоформын серин ба пролин руу орохо гүйдэл нэмэгдэһэн байна (Зураг S5E). GLS ба GPT2-эй дэмжэһэн урбалнууд глутаминһаа глутамат синтез болон глутамат ба α-кетоглутарат хоорондын трансаминацида харюусаха тула тэдэнэй үргэдхэл OXPHOS-дутагдалтай нейронууд глутамат эрилтэ нэмэгдэһэн байна гэжэ харуулна, энэнь пролинай биосинтез нэмэгдэһэниие хадгалха зорилготой байжа болохо (Зураг S5). Эдэ хубилалтануудһаа илгаатайгаар, PN-тодорхой Mfn2cKO хулганануудай тархиин астроцитын протеомическа шэнжэлэл эдэ замууд (бүхы антипероксидазануудые багтааһан) илгаралда ехээр хубилдаггүй гэжэ харуулаа, тиимэһээ энэ бодосой хубилалтын һэлгэлтэ доройтоһон PN-дэ шэлэн абадаг гэжэ харуулаа (Зураг S6, D-һээ G хүрэтэр).
Дүн гаргахада, эдэ шэнжэлэлнүүд PN-үүдэй тусхай бодосой солилсооной замуудай саг хугасаанай эдэбхижүүлгын нилээд илгаатай хэб маягые элирүүлһэн байна. Хэдыгээр нейронуудай митохондриин үйлэ ажалалгаа эртын атеросклероз болон 1C-эй шэнэлэлтэ (Зураг 3Е ба Зураг S5C), бүри I ба IV комплексын илгарал уридшалан мэдэгдэхэ хубилалтада хүргэдэгшье һаа, серин de novo синтезэй хубилалтанууд гансал һүүлшын шатада элирдэг. OXPHOS-ай үйлэ ажаллалгын алдагдалга (Зураг 3Е ба Зураг S5C). Эдэ ололтонь стрессһээ үүдэһэн митохондриин (1С цикл) ба цитоплазмын (серинэй биосинтез) харюу нейронуудай бодосой солилсоое шэнэлхэ зорилгоор ТСА циклэй атеросклерозой нэмэгдэлтэй хамта синергетикээр харюусадаг дараалалтай үйлэ ябасые тодорхойлно.
долоон хоногой OXPHOS-дутагдалтай PN-үүд үндэр дабтамжын һэдэлгэтэй үйлэ ажаллалгые хадгалжа, митохондриин үйлэ ажаллалгын алдагдалые нэхэмжэлхын тулада үндэр хэмжээнэй бодосой солилсооной дахин холбоо дабажа шададаг. Энэ нээлтэнь энэ үедэшье эдэ эсүүд нейродегенерациие хойшолуулха гү, али һэргылхэ эмнэлгын оролдолго абажа болохо гэһэн һонирхолтой арга боломжые үүсхэнэ. Орой. Бидэ энэ боломжые хоёр бэеэ дааһан оролдолгоор шиидхэбэбди. Түрүүшын аргаар бидэ Cre-дулдыданги адено-холбоотой вирус (AAV) вектор зохёогообди, тиимэһээ MFN2 OXPHOS-дутагдалтай PN-үүдтэ in vivo шэлэн илгаруулха аргатай (Зураг S7A). MFN2 кодлодог AAV ба флуоресцентнэ репортер ген mCherry (Mfn2-AAV) in vitro анханай нейроной соёлдо шалгагдаа, энэнь MFN2-ые Cre-дулдыданги аргаар илгаруулха боломжо олгожо, митохондриин морфологиие абарһан, тиигэжэ Mfn2cKO нейронуудта нейромутациһаа сэргийлһэн (Зураг S7, D ба D). Удаань, бидэ 8 долоон хоногой Mfn2-AAV-ые Mfn2cKO болон хяналтын хулганануудай тархиин хабтагайда стереотактикын аргаар хүргэхэ in vivo туршалгануудые үнгэргэжэ, 12 долоон хоногой хулганануудые шэнжэлээбди (Зураг 4А). Эмшэлһэн Mfn2cKO хулгананууд үхөө (Зураг 1, А ба В) (16). In vivo вирусай дамжуулга зарим тархиин дүхэригүүдтэ PN-эй шэлэн илгарал үүсхэбэ (Зураг S7, G ба H). Гансал mCherry (Ctrl-AAV) илгаруулдаг хяналтын AAV тарилга Mfn2cKO амитадай нейродегенерациин хэмжээндэ үндэр нүлөө үзүүлээгүй. Харин Mfn2-AAV-ээр дамжуулһан Mfn2cKO-нуудай шэнжэлэл PN эсэй дабхаргын үндэр хамгаалха нүлөөе харуулһан байна (Зураг 4, В ба С). Тэрэ тоодо, нейронуудай нягташал хяналтын амитадһаа илгархагүй шахуу (Зураг 4, В ба С, ба Зураг S7, Н ба I). MFN1-эй илгарал, харин MFN2-эй илгарал нейронуудай үхэлые абархада адли үрэ дүнтэй (Зураг 4C ба Зураг S7, C ба F), энэнь эктопическа MFN1-эй илгарал MFN2-эй дутагдалые үрэ дүнтэйгээр нэмэгдүүлжэ шадаха гэжэ харуулна. Нэгэ PN түбшэндэ саашадаа шэнжэлэлгын дүнгөөр ​​Mfn2-AAV митохондриин ультраструктурые ехэнхидээ абарһан, mtDNA түбшэниие нормализацилһан, ангиогенезэй эсрэг тэмдэглэгшэ PCx-эй үндэр илгаралые һэлгэһэн байна (Зураг 4, C-һээ E хүрэтэр). Абарагдаһан Mfn2cKO хулганануудые амаралтада байхадаа нюдөөр шалгахада, тэдэнэй бэеын байдал ба хүдэлөөнэй шэнжэнүүд (S1-һээ S3 хүрэтэр хүдэлөөн) һайжарһан байна. Түгэсхэлдэнь, эдэ туршалганууд OXPHOS-да ехэ дутагдалтай PN-үүдтэ MFN2-ые хойшолуулан дахин нэбтэрүүлхэ нь mtDNA-гай хэрэглээе һэргээхэ ба атеросклероз үүсхэхэ, тиигэжэ in vivo аксоной үхэл ба нейронуудай үхэлые һэргылхэ хангалтатай гэжэ харуулна.
(A) Зааһан бодосой солилсооной замые эдэбхижүүлһэн үедэ MFN2 кодлодог AAV тарилгын туршалгын график харуулһан схема. (B) Mfn2cKO хулганануудта 8 долоон хоногто трансдукцилагдаһан 12 долоон хоногой тархиин шэлбэнүүдэй түлөөлһэн конфокальна дүрсэнүүд ба анти-Кальбиндин эсэргүү бодосоор тэмдэглэгдэһэн. Баруун тээ: Аксоной утаһанай хэмжүүр. Аксоной томошуулха хэмжээнь 450 ба 75 мкм байна. (C) Зүүн: AAV трансдукциин циклдэ (AAV+) Пуркинже эсэй нягтые тодорхойлолго (дисперсиин нэгэ талаһаа шэнжэлэл; n = 3 хулгана). Баруун тээ: 12-дохи долоон хоногто трансдукцилагдаһан PN-дэ mtDNA фокус шэнжэлэл (хосгүй t-шалгалта; гурбан хулганаһаа n = 6 эс). * P <0.05; ** P <0.01. (D) Зааһан вирусай векторнуудаар дамжуулһан Mfn2cKO тархиин хэһэгүүдэй PN-эй түлөөлһэн дамжуулгын электрон микрографууд. Ягаан маска дендритүүдэй эзэлһэн газарые харуулна, харин шара точкотой дүрбэлжэн баруун талада үгтэһэн томошуулга харуулна; n голые тэмдэглэнэ. Хэмжээнэй зурлаа, 1μm. (E) 12 долоон хоногто дамжуулагдаһан PN-дэ PCx будалга жэшээ харуулна. Хэмжээнэй зурлаа, 20μm. OE, үлүү илгарал; FC, нугалха хубилалта.
Һүүлдэнь, бидэ OXPHOS-ай үйлэ ажаллалгын алдагдалда ороһон PN-үүдтэ пероксидазаар үүсхэгдэһэн эсэй амидаралай шухала үүргые шэнжэлээбди. Бидэ хулгана PCx мРНК (AAV-shPCx) тусхайтаар зорюулһан AAV-shRNA (богони үсэгэлдэрэй РНК) кодировалһан mCherry бүтээжэ, Mfn2cKO хулганануудай тархиин тархида вирус гү, али тэрэнэй шэрүүн ударидалга (AAV-scr) таряабди. PCx-эй илгарал нэмэгдэһэн (Зураг 3С) ба PN эсэй дабхаргынь бүтэн байһан (Зураг 1А) үедэ PCx-эй үрэ дүнтэй нокдаун абахын тулада тарилга дүрбэдэхи долоон хоногто (Зураг 5А) хэгдэһэн байна. PCx-ые унагаахада (Зураг S8A) халдабарита бэһэлигтэ хизаарлагдадаг PN үхэлэй нилээд хурдадхал болодог гэжэ тэмдэглэхэ шухала (Зураг 5, B ба C). PCx-эй дээшээ зохисуулхаһаа үүдэһэн бодосой солилсооной нүлөөнэй механизмые ойлгохын тулада бидэ PCx-эй нокдаунай һүүлдэ PN-эй редокс байдалые шэнжэлжэ, AAV-зууршалһан оптикын биодатчик Grx1-roGFP2-ые нэгэ доро илгаруулһан (Зураг S8, B-һээ D хүрэтэр) глутатионой харисангы редокс пептидэй потенциалые сэгнэхэ (383). Удаань, бидэ FLIM-эй байдалые шалгаһанай һүүлдэ цитоплазмын редокс байдалай боломжотой хубилалтануудые элирүүлхын тулада 7 долоон хоногой Mfn2cKO гү, али хяналтын үхибүүдэй хурц тархиин хэһэгүүдтэ хоёр фотоной флуоресценциин амидаралай дүрсэлэлгын микроскопи (FLIM) хээбди (Зураг S8, E-һээ G хүрэтэр). Шэнжэлэлгын дүнгөөр ​​PCx илгаралгүй нэгэ Mfn2cKO PN-эй исэлдэлтын байдал мэдэгдэхээр нэмэгдэһэн байна, энэнь хяналтын нейронуудһаа гү, али гансал скрамблированна shRNA илгаруулдаг Mfn2cKO PN-һээ илгаатай (Зураг 5, D ба E). PCx-эй илгарал доошоо зохисуулагдахада, Mfn2cKO PN-эй ехэ исэлдэһэн байдалые харуулһан хубинь гурба дахин үлүү нэмэгдэһэн байна (Зураг 5Е), энэнь PCx-эй дээшэ зохисуулалта доройтоһон нейронуудай редокс шадабариие хадгалһан гэжэ харуулна.
(A) Зааһан бодосой солилсооной замые эдэбхижүүлһэн үедэ shPCx кодлодог AAV тарилгын туршалгын график харуулһан схема. (B) Mfn2cKO хулганануудай 8 долоон хоногой тархиин хэһэгүүдэй түлөөлһэн конфокальна гэрэл зурагууд 4 долоон хоногто трансдукцилагдаһан ба анти-кальциневин эсэргүү бодосоор тэмдэглэгдэһэн. Хэмжээнэй зурлаа, 450μm. (C) AAV-трансдукцилагдаһан циклнүүдтэ Пуркинже эсэй нягта тодорхойлолто (дисперсиин нэгэ тээшээ шэнжэлэл; n = 3-һаа 4 хулгана хүрэтэр). Мэдээллые дунда зэргын±SEM гэжэ харуулна; ***P<0.001. (D) Түлөөлэгшэ FLIM зураг дээрэ 7 долоон хоногой PN-эй дунда зэргын наһа харуулагдана, энэнь глутатион редокс датчик Grx1-roGFP2-ые зааһан туршалгын нөхцөлд илгаруулдаг. LUT (look-up table) харисаа: амидарха сагай хугасаа (пикосекундаар). Хэмжээнэй зурлаа, 25μm. (E) Гистограмма (D)-һээ Grx1-roGFP2-эй наһанай сэнгэй хубаариие харуулна (n=158-һаа 368 эс хүрэтэр хоёр хулганануудта байдал бүхэндэ). Гистограмма бүхэнэй дээгүүрхи круговой диаграмма: CTRL-AAV-scr-эй дунда зэргын наһанай 1 SD-һээ дээшэ үндэр (улаан, исэлдэһэн) гү, али богони (хүхэ, багадхаһан) наһанай хэмжүүртэй эсүүдэй тоо харуулна. (F) Дурадхагдаһан загбар нейронуудай PCx-эй дээшэлүүлгын хамгаалха нүлөөе харуулна.
Бүхыдөө, эндэ үгэһэн мэдээнүүднай MFN2-эй дахин илгарал OXPHOS-эй хүндэ дутагдал, mtDNA-гай хүндэ хосорол, ista-мэтэ морфологиин тон өөршэлэлтэтэй дэбжэһэн PN-ые бүримүһэн абаржа шадаха, тиигэжэ дэбжэһэн үбшэнүүдтэшье үргэлжэлһэн хүгжэлтые хангаха аргатай гэжэ харуулна. Нейродегенераци эсэй үхэлэй урда тээхи шата тухай һэргээгдэхэ гэршэ болоно. Бодосой солилсооной уян хатан байдалай энэ хэмжээнь нейронуудай атеросклероз (TCA циклэй дахин утаһажуулга) үүсхэхэ шадабариар улам онсологдоно, энэнь OXPHOS дутагдалтай PN-үүдтэ PCx илгаралые даража, эсэй үхэлые нэмэгдүүлдэг, тиигэжэ хамгаалха үүргэ гүйсэдхэнэ (Зураг 5F).
Энэ шэнжэлэлгын үедэ бидэ OXPHOS-эй үйлэ ажаллалгын алдагдалда PN-эй харюу бодосой солилсооной программаар эдэбхижүүлһэн дифференциальна эдэбхижүүлгын замаар TCA циклэй атеросклероз руу аажамаар ойртодог гэһэн баримта үгэбэбди. Бидэ олон нэмэлтэ аргануудаар протеомой шэнжэлэлые баталжа, митохондриин хүндэ дисфункциин бэрхэшээлтэй тулгархадаа нейронууд урид мэдэгдээгүй бодосой солилсооной уян хатан хэлбэритэй байдагые элирүүлээбди. Манай гайхал гэхэдэ, бүхы дахин утаһажуулгын үйлэ ябаса аажамаар ба бусаагдашагүй нейродегенерацитай хамта ерэхэ һүүлшын бодосой хубилалтын байдалые заабол тэмдэглэхэгүй, харин манай мэдээнүүд энэнь эсэй үхэлэй урда тээхи шатадашье заһабарилгын нейрон боложо магадгүй гэжэ тэмдэглэнэ. Функциональна компенсационно механизм. Энэ ололтонь нейронууд бэе махабадта нилээд хэмжээнэй бодосой солилсооной уян хатан байдалые харуулна. Энэ баримта MFN2-эй һүүлдэ дахин нэбтэрүүлгэ гол бодосой солилсооной тэмдэглэгшэдэй илгаралые һэлгэжэ, PN-эй доройтолые һэргылхэ аргатай гэжэ гэршэлнэ. Харин эсэргүүгээр, энэнь атеросклерозые даража, мэдрэлые түргэдүүлдэг. транссексуал.
Манай шэнжэлэлгын эгээл һонирхолтой ололтонь гэхэдэ, OXPHOS дутагдалтай PN-үүд артериосклерозые тусхайтаар эдэбхижүүлдэг ферментүүдые дээшэлүүлжэ, TCA циклэй бодосой солилсоое хубилгадаг. Бодосой солилсооной дахин зохисуулалтань хорото хабдарай эсэй ниитэ шэнжэ болоод заримынь глутамин дээрэ тулгуурилжа TCA циклэй дундажа бодосуудые нэмэжэ, амьсгалха гинжые хүтэлбэрилдэг ба липид ба нуклеотид биосинтезэй уридшалан үйлэдбэрилэлые хадгалдаг һэргээхэ эквивалентүүдые үйлэдбэрилдэг (39 , 40). Һаяын шэнжэлэлгын дүнгөөр ​​OXPHOS-эй үйлэ ажаллалгын алдагдалтай захын эдүүдтэ глутамин/глутамат солилсооной дахин холбоо гол шэнжэ тэмдэг болоно (5, 41), эндэ TCA циклдэ глутамин орохо шэглэл OXPHOS-эй гэмтэлэй хүндэ байдалһаа дулдыдаха (41). ). Гэбэшье, бэеын нейронуудай бодосой солилсооной уян хатан байдалай ямар нэгэн адлирхуу байдал болон үбшэнэй оршон байдалда тэрэнэй боломжотой хамаарал тухай тодорхой баримтанууд дутагдалтай байна. Һаяын in vitro шэнжэлэлгын дүнгөөр, анханай кортикальна нейронууд нейродамжуулгын түлөө глутамат нөөсэ эдэбхижүүлдэг, тиигэжэ бодосой хубилалтын стрессэй байдалда исэлдэлтын бодосой солилсоо ба атеросклерозые дэмжэдэг (42). ТСА циклэй фермент сукцинат дегидрогеназа фармакологиин даралга доро пируват карбоксилировани үрэжүүлһэн тархиин грануляциин нейронуудта оксалоацетат синтезые хадгалдаг гэжэ үзэдэг гэжэ тэмдэглэхэ шухала (34). Гэбэшье, эдэ механизмуудай тархиин эд эстэ физиологиин хамаарал (эндэ атеросклероз гол түлэб астроцитуудта хизаарлагдадаг гэжэ үзэдэг) физиологиин шухала удха шанартай (43). Энэ ушарта манай мэдээнүүд бэе махабадта OXPHOS-ээр гэмтэһэн PN-үүдые BCAA-гай задарал болон пируват карбоксилировани руу шэлжүүлжэ болохо гэжэ харуулна, энэнь TCA-гай пулын дунда зэргын нэмэлтэ хоёр гол эхи һэн. Хэдыгээр нейронуудай энергиин солилсоондо BCAA катаболизмын хуби нэмэри тухай дурадхагдаһаншье һаа, нейродамжуулгада глутамат ба ГАМК-гай үүргэһээ гадна (44), in vivo эдэ механизмуудай гэршэ үгы. Тиимэһээ, үйлэ ажаллалгын алдагдалтай ПН-үүд атеросклерозые нэмэгдүүлжэ, шэнгээхэ үйлэ ябасаар хүтэлбэрилһэн ТСА-гай дунда зэргын хэрэглээе автоматаар нөхэжэ шадаха гэжэ таамаглахада хэсүү бэшэ. Тодорхойгоор хэлэбэл, митохондриин үйлэ ажаллалгын алдагдалтай үржэжэ байһан эсүүдтэ дурадхагдаһан аспартанай хүшэлтүрэгшын нэмэгдэһэн эрэлтые хадгалхын тулада PCx-эй үргэдхэл хэрэгтэй боложо магадгүй (45). Гэбэшье, манай метаболомикын шэнжэлэл Mfn2cKO PN-үүдэй аспартанай хүшэлтүрэгшын тогтомол байдалай хэмжээндэ ямаршье удха шанартай хубилалтануудые элирүүлээгүй (Зураг S6A), энэнь үржэжэ байһан эсүүд болон митозой һүүлшын нейронуудай хоорондохи аспартанай хүшэлые ондо ондоо бодосой солилсооной хэрэглээе харуулна гэжэ таамаглана. Хэдыгээр in vivo дисфункциональна нейронуудта PCx-эй үргэдхэлэй тодорхой механизмые тодорхойлхо хэрэгтэйшье һаа, энэ эртэ харюунь нейронуудай редокс байдалые хадгалхада шухала үүргэ гүйсэдхэнэ гэжэ бидэ харуулаабди, энэнь тархиин шэлбэнүүд дээрэ FLIM туршалгануудта харуулагдаһан байна. Тэрэ тоодо, PN-үүдые PCx-ые дээшэнь зохисуулхаһаа сэргийлхэ нь илүү исэлдэһэн байдалда хүргэжэ, эсэй үхэлые түргэдүүлдэг. BCAA-гай задаралые эдэбхижүүлгэ ба пируватай карбоксилировани хадаа митохондриин үйлэ ажаллалгын алдагдаха захын эдэй шэнжэ шанарые тодорхойлхо арга бэшэ (7). Тиимэһээ тэдэ OXPHOS-дутагдалтай нейронуудай гол шэнжэ тэмдэг болоно, ганса шэнжэ бэшэшье һаа, энэнь нейродегенерацида шухала. .
Тархиин үбшэн хадаа нейродегенеративна үбшэнэй олон янзын түхэл болоод гол түлэб атакси хэлбэритэйгээр илгардаг ба олонхи ушарта PN-ые гэмтээдэг (46). Энэ нейронуудай бүлэглэл митохондриин үйлэ ажаллалгын алдагдалда илангаяа эмзэг байдаг, юундэб гэхэдэ хулганануудта тэдэнэй шэлэн доройтол хүнэй спиноцеребелляр атаксиие тэмдэглэхэ олон мотор шэнжэ тэмдэгүүдые үржүүлхэд хангалтатай байдаг (16, 47, 48). Мэдээсэлэй ёһоор, мутант гентэй трансген хулгана загбар хүнэй спиноцеребелляр атакситай холбоотой ба митохондриин дисфункцитай (49, 50), энэнь PNPH-дэ OXPHOS дутагдалһаа үүдэһэн үрэ дүнгүүдые шэнжэлхэ шухала үүргые онсолон тэмдэглэнэ. Тиимэһээ энэ онсо нейронуудай популяциие үрэ дүнтэйгээр тусгаарлажа, шэнжэлхэ гээшэ илангаяа таарамжатай. Гэбэшье, PN-үүд даралтада ехэ мэдрэмтгий болоод бүхы тархиин эсэй популяциин бага хубиие эзэлдэг ушарһаа омик дээрэ үндэһэлһэн олон шэнжэлэлнүүдтэ тэдэниие бүхэли эсүүд болгон шэлэн тусгаарлаха гээшэ бэрхэшээлтэй асуудал болоод байна. Бусад эсэй түхэлнүүдэй (илангаяа томо хүнэй эдэй) бузарлалта огто үгы болгохо аргагүй шахуушье һаа, бидэ үрэ дүнтэй диссоциациин алхамые FACS-тэй холбожо, доодо шэглэлэй протеомикын шэнжэлэлгын хангалтатай тооной амидарха шадалтай нейронуудые абаабди, тиигээд тархиин бүхы мэдээсэлэй багтаамжатай харисуулхада нилээд үндэр уураг бүрхөөлтэй (3000 оршом уураг) байнабди (155). Бүхы эсэй амидаралые хадгалжа, эндэ үгэһэн аргамнай ганса митохондриин бодосой солилсооной замуудай хубилалтые шалгаха бэшэ, харин тэрэнэй цитоплазмын нүхэдэй хубилалтые шалгаха боломжо олгоно, энэнь эсэй түхэл баяжуулха митохондриин мембранай тэмдэгүүдые хэрэглэхэ арга боломжые дүүргэдэг. Бидэнэй тодорхойлһон арга ганса Пуркинже эсэй шэнжэлэлтэй холбоотой бэшэ, харин үбшэнтэй тархиин бодосой солилсооной хубилалтануудые, тэрэ тоодо митохондриин үйлэ ажаллалгын бусад загбарнуудые шиидхэхэ ямаршье түхэлэй эстэ амархан хэрэглэжэ болоно.
Һүүлдэнь, бидэ энэ бодосой хубилалтын үйлэ ябасада эсэй стрессэй гол шэнжэнүүдые бүримүһэн һэлгэжэ, нейронуудай доройтолһоо һэргылхэ эмнэлгын сонхо элирүүлээбди. Тиимэһээ эндэ тодорхойлһон дахин утаһанай үйлэ ажаллалгын нүлөөе ойлгоходо митохондриин үйлэ ажаллалгын алдагдаха үедэ нейронуудай амидаралые хадгалха боломжотой эмшэлгэнүүд тухай үндэһэн ойлголто үгэхэ аргатай. Энэ заршамые бусад мэдрэлийн үбшэнүүдтэ хэрэглэхэ боломжые бүрин элирүүлхын тулада бусад тархиин эсэй түрэлнүүдэй энергиин солилсооной хубилалтануудые шэнжэлхэ зорилготой ерээдүйн шэнжэлэлгэнүүд хэрэгтэй.
MitoPark хулганануудые урид тодорхойлһон байна (31). loxP хажуугаар Mfn2 генүүдтэй C57BL/6N хулганануудые уридшалан тодорхойлһон (18) ба L7-Cre хулганануудтай (23) гаталһан байна. Үүсэһэн хос гетерозигот үри хүүгэдые удаань гомозигот Mfn2loxP/Mfn2loxP хулганануудтай холбожо, Mfn2-дэ (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre) Пуркинже-тодорхой генэй нокаутуудые бии болгобо. Нэгэ дэд бүлэгтэ Gt (ROSA26) SorStop-mito-YFP аллель (stop-mtYFP) нэмэлтэ гаталалгануудаар нэбтэрүүлэгдэһэн байна (20). Бүхы амитадай процедурые Европын, уласай болон байгуулгын заабаринуудай ёһоор хэжэ, Германиин Хойто Рейн-Вестфалиин Umwelt болон Verbraucherschutz-ай LandesamtfürNatur зүбшөөһэн байна. Амитадай ажал мүн лэ Европын лабораториин амитадай эрдэмэй холбооной холбооной заабариие дагадаг.
Жирэмсэн эхэнэрэй умайн хүзүүе һалгаһанай һүүлдэ хулгана үрэ тусгаарлагдана (E13). Хэнксэй тэнсүүритэй дабһанай уһанда (HBSS) 10 мМ Hepes-ээр нэмэгдэһэн гадаргууе задалжа, папаин (20 U/ml) ба цистеин (1μg/ml) агуулһан Dulbecco-гай Modified Eagle's Medium-да дамжуулһан байна. Эдые DMEM-дэ инкубаци хэжэ) ферментнэ шэнжэлэлгээр илгаруулха. Ml) 37°C-та 20 минутын туршада, удаань 10% үхэрэй урагай һүн нэмэгдэһэн DMEM-дэ механикаар тээрэмдэбэ. Эсүүдые 6 см үрэжүүлгын табагта 2×106 нягтаар гү, али 0.5×105 эс/см2 нягтаар полилизинээр бүрхөөгдэһэн шэл бүрхөөл дээрэ үрэжүүлһэн байна. сагай үнгэрһэн хойно оршон 1% B27 нэмэлтэ ба 0.5 мМ GlutaMax агуулһан Neurobasal һүнгүй оршоноор һэлгэгдэбэ. Удаань нейронуудые туршалгын туршада 37°C ба 5% CO2 температурада байлгажа, долоон хоногто нэгэ удаа эдеэлүүлһэн байна. In vitro-да рекомбинаци үүсхэхэ зорилгоор 3μl (24-худагтай үрэжүүлгын табаг) гү, али 0.5μl (24-худагтай табаг) иимэ AAV9 вирусай векторые in vitro-до хоёрдохи үдэртэ нейронуудые эмшэлхэ хэрэгсэл болгон хэрэглэбэ: AAV9.CMV.PI.eGFP. WPRE.bGH (Addgene, каталогой дугаар 105530-AAV9) ба AAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (Addgene, каталогой дугаар 105545-AAV9).
Хулгана Mfn1 ба Mfn2 нэмэлтэ ДНХ (Addgene плазмида #23212 ба #23213-һаа тус тусдаа абтаһан) C-усадхалай V5 дараалалаар (GKPIPNPLLGLDST) тэмдэглэгдэһэн ба T2A дараалалаар дамжан mCherry-тэй хүрээ соо ниилэһэн байна. Grx1-roGFP2 хадаа Гейдельбергын ТП Дик ДФКЗ (Deutsches Krebsforschungszentrum)-ай бэлэг юм. tdTomato кассетые юрэнхы клонировалгын аргаар һэлгэжэ, кассетые pAAV-CAG-FLEX-tdTomato нюрган руу (Addgene лавлагаанай дугаар 28306) субклонировалжа, pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5, pAAV-CAV-CAG FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5 ба pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 векторнууд. pAAV-CAG-FLEX-mCherry гэһэн хяналтын векторые бии болгохын тулада адли стратеги хэрэглэгдээ. AAV-shPCx бүтэсэ бии болгохын тулада плазмид AAV вектор (VectorBuilder, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA#1]) хэрэгтэй, энэнь хулгана PCx-ые зорюулһан shRNA-ые кодлодог ДНХ-эй дараалалые агуулна (5′CTTTCGCTAGCTAGGCTAAGGCTAAGGCTAAGGCTAAGCTTAGACTTAGA 3′) U6 промоторой ударидалга доро mCherry CMV промоторой ударидалга доро хэрэглэгдэдэг. Тусхай AAV векторнуудые үйлэдбэрилэлэй заабариин ёһоор (Cell Biolabs) ябуулагдаа. Тобшохоноор хэлэбэл, mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5), mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) дамжуулгын плазмидые хэрэглэжэ, 29AV-MFN2-V5 эсэй трансфекци, mCherry (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) гү, али Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2) кодировалха ген, мүн AAV1 капсид уураг ба нэмэлтэ уураг кодлохо плазмид плазмид, кальциин фосфат аргаар. Вирусай түүхэй супернатантые хуурай мүльһэн/этанол ваннада хүлдэхэ-таһалха циклээр абажа, эсүүдые фосфат буфертэй дабһатай уһанда (PBS) лизис хэбэ. AAV векторые таһаралтагүй йодиксанолой градиент ультрацентрифугированиин аргаар (24 часай туршада 32,000 эргэлтэ/мин ба 4°C) сэбэрлээд, Amicon ультра-15 центрифугальна шүүгшэ хэрэглэн концентрировалһан байна. AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [2.9×1013 геномой хуулбари (GC)/мл], AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6.1×1012 GC/ml), AAV1-CAG-FLEX-эй геномой титр уридшалан тодорхойлһон ёһоороо (PCR-54) хэмжүүрээр хэмжэгдэһэн байна -MFN1-V5 (1.9×1013 GC/мл) ба AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8.9×1012 GC/мл).
Анханай нейронуудые мүльһэн хүйтэн 1x PBS-дэ хухалжа, үрэжүүлжэ, удаань 0.5% Triton X-100 / 0.5% натриин дезоксихолат/PBS лизисэй буфертэ фосфатаза ба протеаза дарангылагша (Roche) агуулһан гомогенизацилһан байна. Уураг тодорхойлолго бицинхонинай хүшэлтүрэгшын шэнжэлэл (Thermo Fisher Scientific) хэрэглэн хэгдэһэн байна. Удаань уурагуудые SDS-полиакриламид гель электрофорезээр тусгаарлажа, удаань поливинилиденфторид мембрана дээрэ (GE Healthcare) шүрбэһэн байна. Тодорхой бэшэ газарнуудые хаагаад, анханай эсэргүү бодосоор (дэлгэрэнгы мэдээсэл S1 таблица хараха) 5% һүтэй TBST-дэ (Трис-буфернэ дабһатай уһан Tween-тэй), угаалгын алхамууд болон TBST-дэ хоёрдохи эсэргүү бодосоор инкубаци хэхэ. Анханай эсэргүү бодостой +4°C-та һүниин туршада инкубаци хэхэ. Угаалгын һүүлдэ хоёрдохи эсэргүү бодосые 2 часай туршада танхимай температурада түрхихэ. Удаань, тэрэл толбое анти-β-актин эсэргүү бодосоор инкубаци хэжэ, тэрэл ашаглалга баталагдаа. Химилюминесценцидэ хубилгажа, химилюминесценциие дээшэлүүлжэ илгаруулха (GE Healthcare).
Шэл бүрхөөл дээрэ уридшалан таряалангай нейронуудые 4% параформальдегид (PFA)/PBS-ээр зааһан сагта 10 минутын туршада танхимай температурада бэхижүүлһэн байна. Хушалтануудые түрүүн 0.1% Triton X-100/PBS-ээр 5 минутын туршада танхимай температурада нэбтэрүүлнэ, удаань хааха буфертэ [3% үхэрэй һүнэй альбумин (BSA)/PBS] нэбтэрүүлнэ. Хоёрдохи үдэр хушалтануудые хааха буферээр угаагаад, зохистой флюорофор-конъюгированна хоёрдохи эсэргүү бодосоор 2 часай туршада танхимай температурада инкубаци хэбэ; һүүлдэнь дээжэнүүдые PBS-дэ 4′,6-диамидино-2-Фенилиндол (DAPI)-тай һайнаар угаагаад, Aqua-Poly/Mount-ээр микроскопой слайд дээрэ бэхижүүлээ.
Хулганануудые (эрэ ба эмэ) кетамин (130 мг/кг) ба ксилазин (10 мг/кг) гэдэһэ дотор тарилга хэжэ, арһан доро карпрофен үбшэн намдааха эм (5 мг/кг) оруулһан, стереотактикын хэрэгсэлдэ (Kopf) дулаасуулгын хангамжатай табиһан. Гавлын ясые нээжэ, шүдэнэй дрель хэрэглэн, тархиин гадаргуугай хэһэгые нимгэрүүлжэ, мис яһанда таараха (лямбдаһаа: һүүл 1.8, хажуу 1, IV ба V лобулянуудта таараха). Доорохи судасые таһалхагүйн тулада муруй шприцэй зүүгээр гавлын яс соо багахан нүхэ болгоомжотойгоор хэхэ. Удаань нимгэн татаһан шэл капиллярые микро-нүхэн руу аалиханаар оруулна (-1.3-һаа -1 хүрэтэр хатуу бэеын гэдэһэнэй талада), 200-һаа 300 нл хүрэтэр AAV-ые микро-инжекторто (Narishige) гар шприцээр (Narishige) хэдэн удаа 10-һаа 10 минутын туршада бага даралтада оруулна. Дуһалгын һүүлдэ вирусые бүрин тархахын тулада капиллярые үшөө 10 минутын туршада табигты. Капиллярнуудые татаһанай һүүлдэ шарха үрэһэлые бага болгохын тулада арһаяа болгоомжотойгоор оёжо, амитанай эдэгэхэ боломжо олгоно. Мэс засалай һүүлдэ амитадые хэдэн үдэрэй туршада үбшэн намдааха эмүүдээр (каспофен) эмшэлһэн, энэ үедэ тэдэнэй бэеын байдалые наринаар хинажа, удаань зааһан сагта эвтанази хэһэн байна. Бүхы журамууд Европын, уласай болон байгуулгын заабаринуудай ёһоор үнгэргэгдэһэн ба Германиин Хойто Рейн-Вестфалиин Umwelt болон Verbraucherschutz-ай LandesamtfürNatur-ээр баталагдаһан байна.
Амитадые кетамин (100 мг/кг) ба ксилазин (10 мг/кг)-ээр мэдээгүй болгожо, зүрхэндэ түрүүн 0.1 М PBS-ээр, удаань PBS-дэ 4% PFA-ээр нэбтэрүүлһэн байна. Эдые 4% PFA/PBS-дэ 4°C-та һүниин туршада тайража, бэхижүүлһэн байна. PBS-дэ тогтомол тархиһаа саггитальна хэһэгүүдые (50 мкм зузаантай) бэлдэхэдээ чичиргээтэй хутага (Leica Microsystems GmbH, Вена, Австри) хэрэглэбэ. Хэрбээ ондоо тэмдэглэгдээгүй һаа, сүлөөтэй һэлбэхэ хэһэгүүдые будалга дээрэ (13) тодорхойлһон ёһоор танхимай температурада ба хүдэлгэжэ хэгдэһэн байна. Тобшохоноор хэлэбэл, түрүүн, абтаһан хэһэгүүдые 0.5% Triton X-100/PBS-ээр 15 минутын туршада танхимай температурада нэбтэрүүлһэн байна; зарим эпитопуудта (Pcx ба Shmt2) энэ алхамай орондо 80°C (PH 9) температурада трис-ЭДТА буфер соо 25 минутын туршада шэлбэнүүдые халааха. Удаань, хэһэгүүдые анханай эсэргүү бодосоор (S1 таблица хараха) блокировочно буфертэ (3% BSA/PBS) 4°C-та һүниин туршада хүдэлгэжэ инкубаци хэбэ. Үглөөдэрынь хэһэгүүдые хааха буферээр угаагаад, зохистой флюорофор-конъюгированна хоёрдохи эсэргүү бодосоор 2 часай туршада танхимай температурада инкубаци хэбэ; һүүлдэнь, хэһэгүүдые PBS-дэ һайнаар угаагаад, DAPI-ээр эсэргүү будажа, удаань AquaPolymount-ээр микроскопой слайд дээрэ бэхижүүлээ.
Дээжые зураглахын тулада сагаан гэрэлэй лазер болон 405 диодтой ультраягаан лазераар тоноглогдоһон лазер сканерэй конфокальна микроскоп (TCS SP8-X гү, али TCS Digital Light Sheet, Leica Microsystems) хэрэглэгдээ. Флюорофорые хүдэлгэжэ, гибрид илгаруулагшаар (HyDs) дохёо суглуулжа, LAS-X программна хангамжа хэрэглэн, удаадахи горимоор Найквист дээжэ абахада тааруу дэбтэртэ зурагуудые суглуулһан байна: тоогой бэшэ панелнүүдтэ энэнь үндэр динамик дохёонууд (жэшээнь, соматик эсүүд болон дендритүүдтэ) mtY FPDs-эй Hybrid Detector-эй BPNR-эй зүб тоо горимо). Фон бага болгохын тулада 0.3-һаа 6 нс хүрэтэр хаалга хэрэглэгдэдэг.
Сортировалһан эсүүдэй бодото сагта зураглал. 1% B27 нэмэлтэ ба 0.5 мМ GlutaMax агуулһан Neurobasal-A оршон соо илгаруулһанай удаа эсүүдые дары поли-l-лизинээр бүрхөөгдэһэн шэл слайдууд дээрэ (μ-Slide8 Well, Ibidi, каталогой дугаар 80826) , удаань 37°C-та ба 12 часай туршада эсэй температурада байлгаба шиидэхэ. Сагаан лазертай, HyD, 63×[1.4 тоогой диафрагматай (NA)] тоһоной объективтэй линзэтэй ба дулаасуулгын шататай Leica SP8 лазер сканерэй конфокальна микроскоп дээрэ бодото сагта зураглал хэгдэһэн байна.
Хулгана нүүрһэнтүрэгшын диоксидээр түргэн мэдээгүй болгожо, толгойень таһа сабшажа, тархиие гахайһаа түргэн гаргажа, 200μm зузаантай (13C тэмдэглэхэ туршалгада) гү, али 275μm зузаантай (хоёр фотоной туршалгада) сагитальна хэһэгтэ тайража, иимэ материалнуудаар дүүргэбэ. Вальдорф, Германи) иимэ бодосуудаар дүүргэгдэдэг: 125 мМ мүльһэн хүйтэн, нүүрһэнтүрэгшын ханаһан (95% O2 ба 5% CO2) бага Ca2 + зохиомол нюрган тархиин шэнгэн (ACSF) NaCl, 2.5 мМ KCl, 1.25 мМ натрийн фосфат буфер, NaCl25 мМ, 5% глюза 0.5 мМ CaCl2 ба 3.5 мМ MgCl2 (310-һаа 330 ммоль хүрэтэр осмотик даралтатай). Олдоһон тархиин хэһэгүүдые үндэр Ca2 + ACSF (125.0 мМ NaCl, 2.5 мМ KCl, 1.25 мМ натрийн фосфат буфер, 25.0 мМ NaHCO3, 25.0 мМ d-глюкоза, 10 мМ ба 20 мМ Ca. MgCl2) Дунда) pH 7.4 ба 310-һаа 320 ммоль хүрэтэр).
Зураг абаха үедэ шэлбэнүүдые тусхай зураг абаха таһалга руу абаашажа, туршалга 32°-һаа 33°C хүрэтэр тогтомол температурада ACSF-эй үргэлжэлһэн перфузиин доро хэгдэһэн байна. Олон фотоной лазерна сканерэй микроскоп (TCS SP8 MP-OPO, Leica Microsystems) Leica 25x объективтэй (NA 0.95, уһан), Ti: Sapphire лазертай (Chameleon Vision II, Coherent) зүсэмэй дүрсэлэлдэ хэрэглэгдээ. FLIM модуль (ПикоХарп300, ПикоКвант).
Grx1-roGFP2-ой FLIM. PN-эй цитоплазмын редокс байдалай хубилалтануудые Grx1-roGFP2 биодатчик PN-ые зорюулһан сагиттальна тархиин шэлбэнүүдтэ хоёр фотоной FLIM-ээр хэмжэжэ үзэбэ. PN дабхаргада 50-80 мкм оршом шэлжэлтын гадаргууһаа доошоо шэлэгдэжэ, амидарха аргатай PN (энэнь дендритүүдэй дагуу шүрбэһэтэй бүтэсэ гү, али нейроной морфологиин хубилалтанууд үгы) ба хоёр дахин эерэг roGFP2 датчик ба AAV кодлодог shRNA PCx гү, али тэрэнэй дараалалые хянаха (mCherry coexpressing coexpressing) байхые хангадаг. Нэгэ дэбтэрэй зурагуудые 2 дахин тоон томошуулалтатай суглуулха [һэдэлгэ долгиной ута: 890 нм; 512 нм 512 пиксель]. Илгаруулга: дотоодо HyD, флюоресцеин изотиоцианат (FITC) шүүгшын бүлэг] ба 2-һоо 3 минутын дотор дүрсын дунда зэргые мурые тааруулхын тулада хангалтатай фотонуудые (ниитэдээ 1000 фотонуудые) суглуулһан байхые хангахын тулада хэрэглэнэ. Grx1-roGFP2 зондын нарин нягтые ба FLIM-эй байдалые шалгахадаа roGFP2-эй амидаралай хугасаае хинаха замаар үнгэргэгдэһэн байна, энэнь ACSF-дэ экзогеннэ 10 мМ H2O2 нэмэжэ (исэлдэлтые дээгүүр болгохын тулада, амидаралай хугасаае нэмэгдүүлхэ), удаань 2 мМ дитиотит нэмэжэ (энэнь амидаралай хугасаае багадхаха, наһанай доошололго) (Зураг S8, D-һээ G хүрэтэр). FLIMfit 5.1.1 программын ашаар олдоһон дүнгүүдые шэнжэлжэ, бүхы дүрсын нэгэ экспоненциальна задаралгын мурые хэмжэгдэһэн IRF-дэ (хэрэгсэлэй харюугай функци) тааруулха, χ2 ойролсоогоор 1 болоно. Нэгэ PN-эй амидаралай хугасаае тоолохын тулада мэдрэлийн бэеын тойроод байһан маска гараар зуража, маска бүхэнэй амидаралай хугасаае тоосоолһон байна.
Митохондриин боломжотой шэнжэлэл. Хурц хэһэгые 100 нМ TMRM-ээр 30 минутын туршада перфузиин ACSF-дэ шууд нэмэжэ инкубаци хэһэнэй удаа PN-эй митохондриин потенциал хубилалтые хоёр фотоной микроскопоор хэмжэжэ үзэбэ. TMRM дүрсэлэлгэ 920 нм-тэ зондые хүдэлгэжэ, дотоодо HyD (тетраметилродамин изотиоцианат: 585/40 нм) хэрэглэн дохёо суглуулһан; mtYFP-ые дүрсэлхын тулада адли һэдэлгын долгиной ута хэрэглэжэ, харин ондоо дотоодо HyD (FITC :525/50) хэрэглэжэ. Нэгэ эсэй хэмжээндэ митохондриин боломжые сэгнэхэдээ ImageJ-эй Image Calculator плагин хэрэглэхэ. Тобшохоноор хэлэбэл, плагин тэгшэлгэ: signal = min (mtYFP, TMRM) хадаа Purkinje Somali-да TMRM дохёо харуулһан митохондриин бүһэ нютагые тодорхойлходо хэрэглэгдэдэг. Удаань үрэ дүнтэй маска соохи пиксельэй талмайе тодорхойлжо, удаань mtYFP сувагта таараһан босоо хэмжээнэй нэгэ дэбтэрэй дүрсэ дээрэ нормализацилжа, митохондриин боломжые харуулһан митохондриин фракци абана.
Зурагые Huygens Pro (Scientific Volume Imaging) программын ашаар тайлбарилһан байна. Плиткын сканердаһан зурагуудта LAS-X программын үгэһэн автомат оёдолой алгоритм хэрэглэн нэгэ плиткын монтаж хэгдэнэ. Зурагые шалгаһанай һүүлдэ ImageJ болон Adobe Photoshop хэрэглэн зурагые саашань болбосоруулжа, гэрэлтэ ба илгабариие нэгэ тэгшэ тааруулха. График бэлдэхэдээ Adobe Illustrator хэрэглэхэ.
mtDNA фокус шэнжэлэл. ДНХ-эй эсэргүү эсэргүү бодосуудаар тэмдэглэгдэһэн тархиин хэһэгүүд дээрэ мтДНХ-эй гэмтэлэй тоо конфокальна микроскопоор тодорхойлогдоһон байна. Зорилгото талмай бүхэн эсэй бэе болон эс бүхэнэй голдо бүтээгдэһэн, тус тусдаа талмайнь Multi Measure плагин (ImageJ программна хангамжа) хэрэглэн тоосогдоо. Цитоплазмын талмайе абахын тулада эсэй бэеын талмайһаа ядрогой талмайе хаһаха. Һүүлдэнь, Analyze Particles плагин (ImageJ программна хангамжа) хэрэглэн, босоо зураг дээрэхи mtDNA-ые харуулһан цитоплазмын ДНХ-эй сэгнэлтэнүүдые автоматаар тодорхойлһон ба абтаһан дүнгүүдые CTRL хулганануудай PN дунда зэргээр нормализацилһан байна. Дүн гаргалга нэгэ эсэй нуклеозидуудай дунда зэргын тоогоор харуулагдана.
Уураг илгаралгын шэнжэлэл. Нэгэ эсэй хэмжээндэ PN-дэхи уураг илгаралые сэгнэхэдээ ImageJ-эй Image Calculator плагин хэрэглэхэ. Тобшохоноор хэлэбэл, таараһан каналай нэгэ дабхаргын конфокальна дүрсэ дээрэ, тэгшэлгэ дамжуулан: дохёо = мин (mtYFP, эсэргүү бодос), Пуркина соохи тодорхой эсэргүү бодосдо иммунореактивность харуулһан митохондриин бүһэ элирүүлэгдэнэ. Удаань үрэ дүнтэй маска соохи пиксельэй талмайе тодорхойлжо, удаань харуулһан уурагта митохондриин хубиие абахын тулада mtYFP каналай таараһан босоо хэмжээнэй нэгэ дэбтэрэй дүрсэ дээрэ нормализацилна.
Пуркинже эсэй нягта шэнжэлэл. ImageJ-эй Cell Counter плагиные тоолоһон эсүүдэй эзэлһэн тархиин бэһэлигэй утаһаар тоолоһон Пуркинже эсэй тоое хубаажа Пуркинже нягта сэгнэхэ хэрэгсэл болгон хэрэглэбэ.
Дээжые бэлдэхэ ба суглуулха. Хяналтын бүлэгэй болон Mfn2cKO хулганануудай тархиие 0.1 М фосфат буфертэ (PB) 2% PFA/2.5% глутаральдегидтэ бэхижүүлээд, удаань сормуус (Leica Mikrosysteme GmbH, Вена, Австри) (50-һаа 60 мкм хүрэтэр зузаантай) 2% PFA/2.5% глутаральдегидтэ бэхижүүлһэн байна. тетраоксид ба 1.5% калиин ферроцианид 1 часай туршада танхимай температурада. Хэсэгүүдые нэрэмэл уһаар гурба дахин угаагаад, 1% уранилацетат агуулһан 70%-тай этанолоор 20 минутын туршада будажа абаа. Удаань хэһэгүүдые градуированна спирт соо шэнгээжэ, Durcupan ACM (Araldite casting resin M) эпоксидна давирхай (Electron Microscopy Sciences, catalog number 14040) соо кремниин бүрхөөлтэй шэл слайднуудай хоорондо нэбтэрүүлжэ, һүүлдэнь 60°C-та 48 часай туршада пеэшэндэ полимеризацилһан байна. Тархиин гадаргуугай талмай шэлэгдэжэ, 50 нм-эй нимгэн хэһэгүүдые Leica Ultracut (Leica Mikrosysteme GmbH, Вена, Австри) дээрэ тайража, полистирол плёнкоор бүрхөөгдэһэн 2×1 мм-эй зэд шэлбэтэй тор дээрэ шэлэжэ абаһан байна. Хэсэгүүдые 10 минутын туршада H2O-до 4% уранилацетат уһанда будажа, H2O-до хэдэн дахин угаагаад, удаань H2O-до Рейнольдсын хар тугалганай цитратаар 10 минутын туршада угаагаад, удаань H2O-до хэдэн дахин угааба. Микрографинуудые дамжуулгын электрон микроскопоор Philips CM100 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) TVIPS (Tietz Video and Image Processing System) TemCam-F416 тоон камера (TVIPS GmbH, Gauting, USA) хэрэглэн абаһан байна. Германи).
AAV-ээр халдабарилагдаһан хулганануудай тархиие тусгаарлажа, 1 мм зузаантай саггитальна хэһэг болгон хэршэжэ, AAV-ээр халдабарилагдаһан бэһэлигые (энэнь mCherry илгаруулдаг) элирүүлхын тулада флюоресценциин микроскоп хэрэглэн тархиие шэнжэлһэн байна. Гансал AAV тарилгын үрэ дүндэ Пуркинже эсэй дабхаргые (т.е. бүхы шахуу дабхаргые) дор хаяжа хоёр удаа дараалан тархиин бэһэлигтэ үндэр трансдукциин үрэ дүнтэй болгодог туршалгануудые хэрэглэнэ. AAV-трансдукцилагдаһан циклые һүниин туршада фиксациин һүүлдэ (4% PFA ба 2.5% глутаральдегид 0.1 М какао буфертэ) микродиссекци хэжэ, саашадаа болбосоруулһан байна. EPON нэбтэрүүлхын тулада тогтомол эдые 0.1 М натриин какао буферээр (Applichem) угаагаад, 2% OsO4 (os, Science Services; Caco) 0.1 М натриин какао буфертэ (Applichem) 4 часай туршада инкубаци хэжэ, удаань 2 часай туршада угааба. 0.1 М кокамид буферээр 3 дахин дабтаха. Удаань, эдэй шэнгэнгүй болгохын тулада 4°C-та 15 минутын туршада этанолой урасхал бүхэниие инкубаци хэхэдээ, этанолой дээшэлжэ байһан шэглэлые хэрэглэбэ. Эдые пропиленэй оксид руу шэлжүүлжэ, 4°C-та EPON (Sigma-Aldrich) соо һүниин туршада инкубаци хэбэ. Эдые шэнэхэн EPON-до 2 часай туршада танхимай температурада табижа, 62°C-та 72 часай туршада нэбтэрүүлхэ. Ультрамикротом (Leica Microsystems, UC6) ба алмаз хутага (Diatome, Biel, Switzerland) хэрэглэн 70 нм ультранимгэн хэһэгүүдые тайража, 37°C-та 15 минутын туршада 1.5% уранилацетатаар будажа, 4 минутын туршада хар тугалганай цитрат уһанда будаха. Электрон микрографуудые Camera OneView 4K 16-bit (Gatan) ба DigitalMicrograph программна хангамжаар (Gatan) тоноглогдоһон JEM-2100 Plus дамжуулгын электрон микроскоп (JEOL) хэрэглэн абаһан байна. Шэнжэлэлгын тулада 5000× гү, али 10,000× тоон зумтайгаар электрон микрографуудые абаһан байна.
Митохондриин морфологическа шэнжэлэл. Бүхы шэнжэлэлнүүдтэ ImageJ программын ашаар тус бүриин митохондриин контурнуудые тоон зурагуудта гараар зурагдаһан байна. Ондоо морфологическа үзүүлэлтые шэнжэлнэ. Митохондриин нягташалые эс бүхэнэй ниитэ митохондриин талмайе цитоплазмын талмайда (цитоплазмын талмай = эсэй талмай-эсэй голой талмай) × 100 хубаахада абаһан хубиар тэмдэглэнэ. Митохондриин түхэреэниие [4π∙(талмай/периметр 2)] томьёогоор тоосоно. Митохондриин ista морфологи шэнжэлэгдэжэ, гол хэлбэриингээ ёһоор хоёр бүлэгтэ («гуурһан» ба «хөөһэтэй») хубаагдаһан байна.
Аутофагосомын/лизосомын тоо ба нягта шэнжэлэл. ImageJ программын ашаар тоон зураг дээрэхи аутофагосома/лизосома бүхэнэй контурнуудые гараар зураха. Автофагосомын/лизосомын талмайе эс бүхэнэй ниитэ аутофагосомын/лизосомын бүтэсын талмайе цитоплазмын талмайда (цитоплазмын талмай=эсэй талмай-ядрогой талмай)×100 хубаажа тоосоһон хубиар илэрхылнэ. Аутофагосомын/лизосомын нягтые ниитэ тоое нэгэ эсэй аутофагосомын/лизосомын бүтэсэ (цитоплазмын талмайгаар) (цитоплазмын талмай = эсэй талмай-ядрогой талмай) хубааха замаар тоосоно.
Хурц хубааха ба дээжэ бэлдэхэ тэмдэглэлгэ. Глюкозые тэмдэглэхэ шаардалгатай туршалгануудта тархиин хурц хэһэгүүдые ханаһан нүүрһэнтүрэгшэ (95% O2 ба 5% CO2), үндэр Ca2 + ACSF (125.0 мМ NaCl, 2.5 мМ KCl, 1.25 мМ натрийн фосфат буфер, 2.5 мМ NaCl, 205 мМ NaCl, 5% NaC2) агуулһан уридшалан инкубациин камерада шэлжүүлхэ. d-глюкоза, 1.0 мМ CaCl 2 ба 2.0 мМ MgCl 2, рН 7.4 ба 310-һаа 320 мОсм хүрэтэр тааруулһан), энэ тоодо глюкоза 13 C 6- Глюкозын һэлгэлтэ (Eurisotop, каталогой дугаар CLM-1396). Пируват тэмдэглэхэ шаардалгатай туршалгануудта хурса тархиин хэһэгүүдые үндэр Ca2 + ACSF (125.0 мМ NaCl, 2.5 мМ KCl, 1.25 мМ натрийн фосфат буфер, 25.0 мМ NaHCO3, 25.0 мМ d-глюкоза, 10.0 мМ Ca.Cm ба 200 мМ Ca. MgCl2, pH 7.4 ба 310-һаа 320mOsm хүрэтэр тааруулжа), 1mM 1-[1-13C]пируват (Eurisotop, каталогой дугаар CLM-1082) нэмэхэ. Хэсэгүүдые 37°C-та 90 минутын туршада инкубаци хэхэ. Туршалгын һүүлдэ хэһэгүүдые 75 мМ аммониин карбонат агуулһан уһанай уһанда (рН 7.4) түргэн угаагаад, 40:40:20 (v:v:v) ацетонитрил (ACN): метанол: уһанда гомогенизацилһан байна. Хэсэгүүдые 30 минутын туршада мүльһэн дээрэ инкубаци хэһэнэй удаа дээжэнүүдые 21,000 г-да 10 минутын туршада 4°C-та центрифугировалжа, тунгалаг супернатантые SpeedVac концентратор соо хатааба. Үүсэһэн хатаагдаһан метаболит гранулые шэнжэлэл хэхэ болотор -80°C-та хадагалһан байна.
С-тэмдэгтэй аминохүшэлэй шэнгэн хроматографи-масс-спектрометриин шэнжэлэл. Шэнгэн хроматографи-масс-спектрометриин (LC-MS) шэнжэлэлгын тулада метаболит гранулые 75μl LC-MS сортын уһанда (Honeywell) дахин суспендироваһан байна. 21,000 г-да 4°C-та 5 минутын туршада центрифугировалһанай һүүлдэ 20 мкл тунгалаг супернатантые аминохүшэлэй гүйдэлэй шэнжэлэл хэхэдээ хэрэглэбэ, харин үлэһэн экстрактые анион шэнжэлэл хэхэдээ дары хэрэглэбэ (дооро харагты). Аминокислотын шэнжэлэл уридшалан тодорхойлһон бензоилхлорид деривативизациин протокол (55, 56) хэрэглэн хэгдэһэн байна. Түрүүшын шатада 20 мкл метаболит экстрактда 10 мкл 100 мМ натрийн карбонат (Сигма-Ольдрих) нэмэгдэжэ, удаань LC сортын ACN-дэ 10 мкл 2% бензоилхлорид (Сигма-Ольдрих) нэмэгдэбэ. Дээжые богонихоноор һэлгэжэ, удаань 21,000 г-ээр 20°C-та 5 минутын туршада центрифугировалһан байна. Сэбэрлэгдэһэн супернатантые 2 мл-эй автопробиркын флакон соо конус хэлбэриин шэл оруулгатай (200 мкл эзэлхүүн) оруулха. Дээжые Q-Exactive (QE)-HF (Ultra High Field Orbitrap) үндэр нягта нарин масс-спектрометртэй (Thermo Fisher Scientific) холбоһон Acquity iClass ультра үндэр гүйсэдхэлтэй LC системэ (Waters) хэрэглэн шэнжэлһэн байна. Шэнжэлэлгын тулада 2μl деривативированна дээжые 100×1.0 мм үндэр бата бэхи кремний Т3 колонкодо (Waters) 1.8μm хэһэгүүдтэй таряа. Урдалай хурдадхал 100μl/мин, буферэй системэ буфер А (10 мМ аммониин формиат ба уһанда 0.15% мэрээшэнэй хүшэлтүрэгшэ) ба буфер В (ACN)-һээ бүридэнэ. Градиент иимэ: 0%B 0 минутада; 0%B. 0-һоо 15% хүрэтэр B 0-һоо 0.1 минутын туршада; 15-һаа 17% хүрэтэр В 0.1-һээ 0.5 минутын туршада; В 17-һоо 55% хүрэтэр 0.5-һаа 14 минутада; В 55-һаа 70% хүрэтэр 14-һөө 14.5 минутада; 14.5-һаа 70-һаа 100% хүрэтэр B 18 минутада; 100% B 18-һаа 19 минутада; 100-һаа 0% хүрэтэр В 19-һээ 19.1 минутада; 0% B 19.1-һээ 28 минута хүрэтэр (55, 56). QE-HF масс-спектрометр 50-һаа 750 хүрэтэр m/z (масса/зарядай харисаа) массын диапазонтой эерэг ионизациин горимоор хүдэлдэг. Хэрэглэгдэһэн нягтабаринь 60,000, олоһон олзоборилгын ударидалга (AGC) ионой зорилгонь 3×106, ионой эгээн ехэ саг 10 миллисекунд болоно. Халуун электрошүршүүрэй ионизациин (ESI) эхин 3.5 кВ шүршэхэ хүшэлтүрэгшэ, 250°C капилляр температура, 60 AU (дурын нэгэдэл) бүрхөөлэй агаарай гүйдэл, 20 AU туһаламжатай агаарай гүйдэлтэй хүдэлдэг. 250°C. S линзэ 60 AU-да табигдаһан байна.
13С тэмдэгтэй органическа хүшэлтүрэгшын анион хроматографи-МС шэнжэлэл. Үлэһэн метаболит тунадас (55μl) QE-HF масс-спектрометртэй (Thermo Fisher Scientific) холбогдоһон Dionex ион хроматографиин системэ (ICS 5000+, Thermo Fisher Scientific) хэрэглэн шэнжэлэгдэһэн байна. Тобшохоноор хэлэбэл, 5μl метаболит экстракт Dionex IonPac AS11-HC колонкодо HPLC (2 мм×250 мм, хэһэгэй хэмжээ 4μm, Thermo Fisher Scientific) түлхихэ хэһэгэй циклэй горимоор 1 дүүргэлтын харисаагаар таряа. ) Dionex IonPac AG11-HCguard колонко (x250 mm, 250 мм 4μm, Термо Фишер Сайентифик). Колонкын температура 30°C-та байлгагдажа, автопробирка 6°C-да табигдана. Элюент генератораар дамжуулан калиин гидроксидэй градиент бии болгохын тулада деионизированна уһаар хангагданхай калиин гидроксидэй картридж хэрэглэхэ. Метаболитнуудые 380 мкл/мин гүйдэлэй хурдаар тусгаарлаха, иимэ градиент хэрэглэжэ: 0-һоо 3 минута хүрэтэр, 10 мМ KOH; 3-һаа 12 минута хүрэтэр, 10-һаа 50 мМ KOH; 12-һоо 19 минута хүрэтэр, 50-һаа 100 мМ KOH; 19-һээ 21 минута хүрэтэр, 100 мМ KOH; 21-һээ 21.5 минута хүрэтэр, 100-һаа 10 мМ KOH. Колонко 10 мМ KOH доро 8.5 минутын туршада дахин тэнсүүлэгдэһэн байна.
Элюированна метаболитнуудые колонкын һүүлдэ 150μl/min изопропанолой нэмэлтэ гүйдэлтэй ниилүүлжэ, удаань сүлөөтэ ионизациин горимоор хүдэлдэг үндэр нягта масс-спектрометр руу шэглүүлнэ. MS 60,000 нягтабаритайгаар m/z 50-һаа 750 хүрэтэр массай диапазон хинажа байна. AGC 1×106 болгогдоһон, эгээн ехэ ионой саг 100 мс байлгагдаһан. Халуун ESI эхи 3.5 кВ шүршэхэ хүшэлтүрэгшээр хүдэлдэг байгаа. Ионой эхинэй бусад тохиргоонууд иимэ: капилляр температура 275°C; бүрхөөлэй хиин гүйдэл, 60 AU; туһаламжатай хиин гүйдэл, 300°C-та 20 AU, ба S линзын тохиргоо 60 AU.
13C тэмдэгтэй метаболитнуудай мэдээсэлэй шэнжэлэл. Изотопуудай харисаанай мэдээсэлэй шэнжэлэл хэхэдээ TraceFinder программын (4.2 хубилалта, Thermo Fisher Scientific) хэрэглэхэ. Нэгэдэл бүхэнэй үнэн зүб байдалые найдамтай һургаалта нэгэдэлээр шалгажа, бэеэ дааһан шэнжэлһэн байна. Изотоп баяжуулгын шэнжэлэл хэхэдээ, 13C изотоп бүхэнэй (Mn) абтаһан ион хроматограммын (XIC) талмайе [M + H] + -һаа абтаһан, эндэ n - зорилготой нэгэдэлэй нүүрһэнтүрэгшын тоо, аминохүшэл шэнжэлхэ хэрэгсэл гү, али [ MH] + - анио шэнжэлхэ хэрэгсэл. XIC-эй массай үнэн зүб байдал нэгэ саяда табан хубиһаа бага, RT-эй үнэн зүб байдал 0.05 минута. Баяжуулгын шэнжэлэлые илгарһан изотоп бүхэнэй харисаае хамааралтай нэгэдэлэй бүхы изотопуудай суглуулбарида тоосоолжо хэнэ. Эдэ харисаануудые изотоп бүхэндэ хубиин сэнгээр үгэнэ, үрэ дүнгүүдые уридшалан тодорхойлһон ёһоор (42) моляр хубиин баяжуулга (MPE) гэжэ тэмдэглэнэ.
Хүлдэһэн нейроной гранулые мүльһэн хүйтэн 80% метанол (v/v) соо гомогенизацилжа, һэлгүүлжэ, -20°C-та 30 минутын туршада инкубаци хэбэ. Дээжые дахин һэлгүүлжэ, +4°C-та 30 минутын туршада хүдэлгэхэ. Дээжые 21,000 г-да 4°C-та 5 минутын туршада центрифугировалһан, удаань үрэ дүндэ гараһан супернатантые суглуулжа, 25°C-та SpeedVac концентратор хэрэглэн удаадахи шэнжэлэл хэхэдээ хатаажа абаһан. Дээрэ тэмдэглэгдэһэнэй ёһоор, LC-MS шэнжэлэл ангилагдаһан эсэй аминохүшэлнүүд дээрэ хэгдэһэн байна. TraceFinder (4.2 хубилалта, Thermo Fisher Scientific) хэрэглэн, нэгэдэл бүхэнэй моноизотоп масса хэрэглэн мэдээсэлэй шэнжэлэл хэгдэһэн байна. Метаболит мэдээсэлэй квантильна нормализаци preprocessCore программын багтаамжа (57) хэрэглэн хэгдэһэн байна.
Зүсэм бэлдэлгэ. Хулгана нүүрһэнтүрэгшын диоксидээр түргэн мэдээгүй болгожо, толгойень таһа сабшажа, тархиие гахайн һүүлһээ түргэн гаргажа, мүльһэнөөр дүүргэгдэһэн чичиргээтэй хутагаар (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Germany) 300-һаа 375 мкм хүрэтэр нүүрһэнтүрэгшын хиижүүлгэ ба хүйтэн COd (25% O2) хубаа Бага Ca2 + ACSF (125.0 мМ NaCl, 2.5 мМ KCl, 1.25 мМ натрийн фосфат буфер, 25.0 мМ NaHCO3, 25.0 мМ d-глюкоза, 1.0 мМ CaCl2 ба 6.0 мМ MgCl2 рН-ые 37 ба 30 мМ ба 3 мО хүрэтэр тааруулха). Олдоһон тархиин хэһэгүүдые үндэр Ca2 + ACSF (125.0 мМ NaCl, 2.5 мМ KCl, 1.25 мМ натрийн фосфат буфер, 25.0 мМ NaHCO3, 25.0 мМ d-глюкоза, 4.0 мМ CaCl ба 2.3 мМ MCg) агуулһан камерада шэлжүүлхэ 7.4 ба 310-һаа 320 мОсм хүрэтэр). Зүсэмүүдые 20-30 минутын туршада хадагалха, тиигэбэл тэдэниие бэшэхэһээ урид һэргээхэ аргатай болохо.
бэшэлгэ. Бүхы бэшэлгэнүүдтэ тогтомол тэмдэглэхэ танхимтай, 20 дахин уһанда шэнгээхэ объективтэй (Scientifica) микроскопой шата хэрэглэгдээ. Пуркинже эсүүдые (i) бэеын хэмжээгээр, (ii) тархиин анатомическа байрлалгаар, (iii) флюоресцентнэ mtYFP репортер генэй илгаралаар тодорхойлһон байна. 5-һаа 11 мегом хүрэтэр үзүүрэй эсэргүүсэлтэй заһабариин пипеткые боросиликат шэл капилляр (GB150-10, 0.86 мм×1.5 мм×100 мм, Science Products, Hofheim, Germany) ба горизонталь пипеткээр Instruments (P-10000, Sutter, Sutter, CA) татажа гаргадаг. Бүхы бэшэлгэнүүдые ELC-03XS npi патч-кламп амплификатораар (npi electronic GmbH, Tam, Germany) хэһэн байна, энэнь Signal (6.0 хубилалта, Cambridge Electronic, Cambridge, UK) программын ашаар ударидадаг байгаа. Туршалга 12.5 кГц-эй дээжэ абаха хурдаар бүридхэгдэһэн байна. Дохи 1.3 ба 10 кГц тус тусдаа таһалха давтамжатай хоёр богони дамжуулгын Бесселэй шүүгшээр шүүгдэнэ. Мембрана ба пипеткын багтаамжые хүсэдлэгшэ хэрэглэн компенсационно хэлхеэ холбоогоор нэхэмжэлнэ. Бүхы туршалгануудые Orca-Flash 4.0 камерын (Hamamatsu, Gerden, Germany) ударидалга доро үнгэргэһэн, энэнь Hokawo программын (2.8 хубилалта, Hamamatsu, Gerden, Germany) ударидалга доро байгаа.
Бүхы эсэй журамта тохиргоо ба шэнжэлэл. Бэшэхэһээ урид пипеткэ соо иимэ бодосуудые агуулһан дотоодо урасхалаар дүүргэхэ: 4.0 мМ KCl, 2.0 мМ NaCl, 0.2 мМ EGTA, 135.0 мМ калиин глюконат, 10.0 мМ Hepes, 4.0 мМ ATP (ММ глюконат), 50 мМ гуфосифат. (GTP) (Na) ба 10.0 мМ креатинин фосфат рН 7.25 хүрэтэр тааруулһан, осмотик даралтань 290 мОсм (сахароза) байгаа. Мембраные таһалхын тулада 0 pA хүсэн хэрэглэһэнэй дараа дары амаралтада байһан мембранай потенциалые хэмжэжэ үзэбэ. Оролто эсэргүүсэлые -40, -30, -20, ба -10 pA гиперполяризацилагдаһан гүйдэл хэрэглэжэ хэмжэнэ. Хүдэлөөнэй харюугай хэмжээе хэмжэжэ, Омой хуули хэрэглэн оролто эсэргүүсэлые тоолохо. Аяндаа үйлэ ажалалгаа 5 минутын туршада хүшэлтүрэгшын зажимда бүридхэгдэжэ, sPSC-ые Igor Pro (32 7.01 хубилалта, WaveMetrics, Lake Oswego, Oregon, USA)-да хахад автомат таниха скрипт хэрэглэн элирүүлжэ хэмжэжэ үзэбэ. IV муруй ба тогтомол гүйдэлые батарейе ондо ондоо потенциалда (-110 мВ-һээ эхилээд) хабшуулжа, 5 мВ алхамуудаар хүшэлтүрэгшые нэмэгдүүлжэ хэмжэнэ. АП-эй үйлэдбэрилэлые деполяризациин гүйдэл хэрэглэжэ туршаһан байна. Деполяризациин гүйдэлэй импульс хэрэглэжэ байхадаа эсые -70 мВ-ээр хабшуулха. Бэшэлгын нэгэдэл бүхэнэй алхам хэмжээе тус тустаа (10-һаа 60 pA хүрэтэр) тааруулха. Эгээн ехэ AP дабтамжые үүсхэһэн импульсын үсэлтые гараар тооложо, AP-эй эгээн ехэ дабтамжые тоолохо. АП босоо хэмжээе анха нэгэ гү, али хэдэн АП-ые үүсхэһэн деполяризациин импульсын хоёрдохи гаралтайе хэрэглэн шэнжэлнэ.
Нүхэтэй заһабариин тохиргоо ба шэнжэлэл. Стандарт протоколнуудые хэрэглэн нүхэлһэн заһабариин бүридхэл хэхэ. 128 мМ глюконат K, 10 мМ KCl, 10 мМ Hepes, 0.1 мМ EGTA ба 2 мМ MgCl2 агуулһан АТФ- ба ГТФ-гүй пипетка хэрэглэжэ, рН 7.2 хүрэтэр тааруулха (KOH хэрэглэн). Эсэй мембранай хяналтатай бэшэ нэбтэрэлгые һэргылхын тулада эс доторхи уһанда АТФ ба ГТФ орхигдодог. Заһабариин пипеткые амфотерицин агуулһан дотоодо уһанда (ойролсоогоор 200-һаа 250 мкг/мл; G4888, Sigma-Aldrich) дүүргэжэ, хадхагдаһан заһабариин тэмдэглэл абана. Амфотерицин диметилсульфоксидтэ (һүүлшын концентраци: 0.1-һээ 0.3% хүрэтэр; DMSO; D8418, Sigma-Aldrich) уһалагдаһан байна. Хэрэглэгдэһэн ДМСО-гой концентраци шэнжэлэгдэһэн нейронуудта удха шанартай нүлөө үзүүлээгүй. Сохихо үйлэ ябасада суваг эсэргүүсэл (Ra) үргэлжэ хинажа, Ra ба AP-эй дабхаргын тогтоһоной һүүлдэ туршалга эхилһэн (20-40 минута). Аяндаа үйлэ ажалалгаа 2-һоо 5 минутын туршада хүшэлтүрэгшэ ба/гү, али гүйдэлэй зажим соо хэмжэгдэнэ. Мэдээлэлэй шэнжэлэлгэ Igor Pro (7.05.2 хубилалта, WaveMetrics, АНУ), Excel (2010 оной хубилалта, Microsoft Corporation, Redmond, USA) болон GraphPad Prism (8.1.2 хубилалта, GraphPad Software Inc., La Jolla, CA) хэрэглэн хэгдэһэн байна. АНУ). Аяндаа AP-нуудые элирүүлхын тулада IgorPro-гой NeuroMatic v3.0c плагин хэрэглэгдэдэг. Үгтэһэн босоо хэмжээе хэрэглэн AP-нуудые автоматаар элирүүлхэ, энэнь тэмдэглэл бүхэндэ тус тустаа тааруулагдадаг. Спикын забһарые хэрэглэн, эгээн ехэ агшин зуурын спикын дабтамжа ба дунда зэргын спикын дабтамжатай спикын дабтамжые тодорхойлхо.
PN тусгаарлалта. Урдань хэблэгдэһэн протоколдо дасан зохицожо, PN-үүдые хулганануудай тархиһаа тодорхой шатада сэбэрлэбэ (58). Тобшохоноор хэлэбэл, тархиие мүльһэн хүйтэн диссоциациин оршондо [HBSS Ca2+ ба Mg2+гүйгөөр, 20 мМ глюкоза, пенициллин (50 U/ml) ба стрептомицин (0.05 мг/мл) нэмэгдэһэн] тайража, удаань оршониие папаин [HBSS Ca2+ ба Mg2+ нэмэгдэһэн) няһалһан, удаань папаин оршондо [HBSS, HC-S · (1 мг / мл), папаин (16 Е / мл) ба дезоксирибонуклеаза I (ДНаза I; 0.1 мг/мл)] 30°C-та 30 минутын туршада эмшэлхэ. Нэн түрүүн эдые үндэгэнэй шүлһэ (10 мг/мл), BSA (10 мг/мл) ба DNase (0.1 мг/мл) агуулһан HBSS оршондо ферментнэ шэнжэлэлгэһээ һэргылхын тулада танхимай температурада угааха, удаань 20 мМ глюкоза агуулһан HBSS оршондо HBSS оршон соо зөөлэнөөр нунтаглажа, пейлин, стриплин (10 мг/мл) (0.05 мг/мл) ба ДНаза (0.1 мг/мл) ганса эсые гаргадаг. Үүсэһэн эсэй суспензиие 70 мкм эсэй шүүгшэ дамжуулан шүүжэ, удаань эсүүдые центрифугировалжа (1110 эргэлтэ/мин, 5 минута, 4°C) гранулировалжа, сортын оршондо дахин суспендироваһан [HBSS, 20 мМ глюкозоор нэмэгдэһэн, 20% үхэрэй урагай нэмэгдэһэн) Сыворотка, пелиниин (50/5/5) стрептококк (0.05 мг/мл)]; пропидиин йодидээр эсэй амидарал сэгнэжэ, эсэй нягтые 1×106-һаа 2×106 эс/мл хүрэтэр тааруулха. Урдалай цитометриин урда тээ суспензиие 50 мкм эсэй шүүгшэ дамжуулан шүүһэн байна.
Урдалай цитометр. Эсэй илгарал 4°C-та FACSAria III машина (BD Biosciences) ба FACSDiva программын (BD Biosciences, 8.0.1 хубилалта) хэрэглэн хэгдэһэн байна. Эсэй суспензиие 100 мкм сорго хэрэглэн 20 psi даралта доро ~2800 үйлэ ябадал/сек хурдаар илгаруулһан байна. Уламжалалта үүдэлгын шалгуурнууд (эсэй хэмжээ, бимодаль илгарал, тархалта шэнжэ) бусад эсэй түхэлнүүдһээ PN-ые зүбөөр тусгаарлаха аргагүй тула үүдэнэй стратеги mitoYFP+ ​​ба хяналтын mitoYFP − хулганануудта YFP эршэм хүсэн ба автофлюоресценциин шууд зэргэсүүлгэ дээрэ үндэһэлжэ табигдана. YFP 488 нм лазерай шугамаар дээжые туяалуулха замаар эдэбхижүүлэгдэдэг ба 530/30 нм зурбаһанай дамжуулгын шүүгшэ хэрэглэн дохёо илгаруулагдадаг. mitoYFP+ ​​хулганануудта Rosa26-mitoYFP репортер генэй харисангы хүсые нейронуудай бэе ба аксоной хэһэгүүдые илгаруулхада баһа хэрэглэдэг. 7-AAD 561 нм шара лазераар эдэбхижүүлэгдэжэ, үхэһэн эсүүдые хаһахын тулада 675/20 нм зурбаһанай шүүгшэтэй илгаруулагдана. Астроцитые нэгэ доро тусгаарлахын тулада эсэй суспензиие ACSA-2-APC-ээр будажа, удаань дээжые 640 нм лазерай шугамаар туяалуулжа, 660/20 нм зурбаһанай шүүгшэ хэрэглэн дохёо элирүүлһэн байна.
Суглуулһан эсүүдые центрифугировалжа (1110 эргэлтэ/мин, 5 минута, 4°C) грануляци хэжэ, хэрэглэхэ болотор -80°C-та хадагалһан байна. Mfn2cKO хулгананууд болон тэдэнэй үхибүүдые нэгэ үдэртэ ангилжа, процедурын хубилалтые бага болгодог. FACS мэдээсэлэй танилсуулга ба шэнжэлэл FlowJo программын ашаар хэгдэһэн байна (FlowJo LLC, Ashland, Oregon, USA).
Дээрэ хэлэгдэһэнэй ёһоор (59), бодото сагта ПЦР-ые удаадахи mtDNA-гай тоосоололдо илгаруулһан нейронуудһаа ДНХ-ые тусгаарлаха хэрэгсэл болгон хэрэглэдэг. Шугаман байдал ба босоо мэдрэмжэ анха ондо ондоо тооной эсүүд дээрэ qPCR-ээр туршаһан байна. Тобшохоноор хэлэбэл, 50 мМ трис-HCl (pH 8.5), 1 мМ EDTA, 0.5% Tween 20 ба протеиназа K (200 нг/мл)-һээ бүридэһэн лизисэй буфер соо 300 PN суглуулжа, 55°C-та 120 минута соо инкубаци хэхэ. Эсүүдые 95°C-та 10 минутын туршада инкубаци хэжэ, протеиназа K-ые бүрин эдэбхигүй болгоһон байна. mt-Nd1-дэ тусхай TaqMan зонд (Thermo Fisher) хэрэглэн, mtDNA-ые 7900HT Real-Time PCR системэдэ (Thermoherific Scientifics) хахад тоогой ПЦР-ээр хэмжэжэ үзэбэ. Эрдэм ухаан, каталогой дугаар Mm04225274_s1), mt-Nd6 (Термо Фишер Сайентифик, каталогой дугаар AIVI3E8) ба 18S (Термо Фишер Сайентифик, каталогой дугаар Hs99999901_s1) генүүд.
Протеомой дээжэ бэлдэхэ. Уусмалые 95°C-та 10 минутын туршада халаажа, лизисын буфер соо [6 М гуанидин хлорид, 10 мМ трис(2-карбоксиэтил) фосфинай гидрохлорид, 10 мМ хлорацетамид ба 100 мМ трис-лизэй хүлдэһэн нейрон грануляцинууд] ультразвугоор хүдэлгэжэ. Биоруптор (Диагенод) дээрэ 10 минута (30 секундын пульс / 30 секундын зогсолто). Дээжые 20 мМ трис-HCl (рН 8.0)-да 1:10 шэнгээжэ, 300 нг трипсин алтантай (Promega) холижо, 37°C-та һүниин туршада инкубаци хэжэ, бүрин шэнгээһэн байна. Хоёрдохи үдэр дээжые 20,000 г-ээр 20 минутын туршада центрифугировалһан байна. Супернатантые 0.1% мэрээшэнэй хүшэлтүрэгшээр шэлжүүлжэ, урасхалые өөрөө хэһэн StageTips-ээр дабһагүй болгоһон байна. Дээжые SpeedVac хэрэгсэлдэ (Эппендорфын концентратор нэмэжэ 5305) 45°C-та хатаажа, удаань пептидые 0.1% мэрээшэнэй хүшэлтүрэгшэдэ суспендироваһан байна. Бүхы дээжэнүүдые нэгэ хүн нэгэ доро бэлдэһэн байна. Астроцитын дээжые шэнжэлхын тулада 4 мкг дабһагүй пептидүүдые тандем массын тэмдэгээр (TMT10plex, каталогой дугаар 90110, Thermo Fisher Scientific) 1:20 пептид ба TMT реагент харисаагаар тэмдэглэбэ. ТМТ тэмдэглэхэдээ, 0.8 мг ТМТ реагентые 70 мкл уһангүй ACN-дэ дахин суспендироваад, хатаагдаһан пептидые 9 мкл 0.1 М TEAB (триэтиламмоний бикарбонат) болгон һэргээжэ, тэрээндээ 7 мкл ТМТ реагент ACN-дэ нэмэбэ. Концентрацинь 43.75% байгаа. минутын инкубациин һүүлдэ 2 мкл 5% гидроксиламинаар урбалые унтараа. Тэмдэглэгдэһэн пептидүүдые суглуулжа, хатаажа, 200μl 0.1% мэрээшэнэй хүшэлтүрэгшэдэ (FA) дахин суспендироваад, хоёр хубаажа, өөрөө хэһэн StageTips хэрэглэн дабһагүй болгоо. UltiMate 3000 ультра үндэр гүйсэдхэлтэй шэнгэн хроматограф (UltiMate 3000 ультра үндэр гүйсэдхэлтэй шэнгэн хроматограф) хэрэглэн, хоёр хахадһаа нэгыень 130Å1.7μm C18 хэһэгүүдээр дүүргэгдэһэн 1mm x 150mm Acquity хроматографическа колонко дээрэ фракционировалһан байна (Waters, каталог No SKU: 1985665). Термо Фишер Сайентифик). Пептидүүдые 30μl/мин гүйдэлэй хурдаар илгажа, 1%-һаа 50% хүрэтэр В буферые 85 минутын туршада 96 минутын шата шатаар градиентээр, 50%-һаа 95% хүрэтэр В буферые 3 минутын туршада, удаань 95 % В буферые 8 минутын туршада тусгаарлаха; А буфер 5% ACN ба 10 мМ аммониин бикарбонат (ABC), В буфер 80% ACN ба 10 мМ ABC. минута бүхэндэ фракцинуудые суглуулжа, хоёр бүлэг болгон (1 + 17, 2 + 18 гэхэ мэтэ) хубаажа, вакуум центрифугада хатааха.
LC-MS/MS шэнжэлэл. Масс-спектрометриин түлөө пептидүүдые (r119.aq дугаар) 25 см, 75 мкм дотоодо диаметртэй PicoFrit шэнжэлэлгын колонко дээрэ (шэнэ объективэй линзэ, PF7508250 дугаартай) 1.9 мкм ReproSil-Pur 120 C18-AQD дунда зэргээр тоноглогдоһон, Maischr-YAS, Maisch-YAS. 1200 (Термо Фишер Сайентифик, Германи). Колонко 50°C-та байлгагдаа. А ба В буфернууд тус тусдаа уһанда 0.1% мэрээшэнэй хүшэлтүрэгшэ ба 80% ACN-дэ 0.1% мэрээшэнэй хүшэлтүрэгшэ юм. Пептидүүдые 6%-һаа 31% хүрэтэр В буферһээ 65 минутын туршада, 31%-һаа 50% хүрэтэр В буферһээ 5 минутын туршада 200 нл/мин градиентээр тусгаарлаһан байна. Элюированна пептидүүдые Orbitrap Fusion масс-спектрометр дээрэ (Thermo Fisher Scientific) шэнжэлһэн байна. Пептидэй уридшалан m/z хэмжүүрые 350-һаа 1500 m/z хүрэтэр 120,000 нягтатайгаар хэнэ. 27% нормализацилагдаһан мүргэлдэхэ энергиие хэрэглэн, 2-һоо 6 хүрэтэр зарядтай эгээн хүсэтэй уридшалан үүсхэгшэ үндэр энергиин С урбалай диссоциациин (HCD) задаралгада шэлэгдэнэ. Циклэй саг 1 с гэжэ тохируулагдаһан байна. Пептидэй хэһэгэй m/z сэн 5×104-эй эгээл бага AGC зорилго ба 86 мс-эй эгээл ехэ тарилгын сагые хэрэглэн ион урбаанда хэмжэгдэһэн байна. Хубаагдаһанай һүүлдэ уридшалан үүсхэгшэ 45 секундын туршада динамическа хасагдаха жагсаалтада табигдаһан байна. ТМТ-тэмдэгтэй пептидүүдые 50 см, 75 мкм Acclaim PepMap багана дээрэ (Thermo Fisher Scientific, каталогой дугаар 164942) тусгаарлажа, нүүдэлэй спектрнүүдые Orbitrap Lumos Tribrid масс-спектрометр дээрэ (Thermo Fisher Scientific) шэнжэлһэн, энэнь үндэр тэгшэ бэшэ долгиной (IMS) долгиной ионоор тоноглогдоһон байна тоног түхеэрэмжэ (Thermo Fisher Scientific) −50 ба −70 В хоёр компенсациин хүшэлтүрэгшэдэ хүдэлдэг. Синхронизациин уридшалан шэлэгдэhэн MS3 TMT мэдээсэлэй ионой дохёо хэмжэхэ хэрэгсэлдэ хэрэглэгдэдэг. Пептидэй тусгаарлалта EASY-nLC 1200 дээрэ 90% шугаман градиент элюци хэрэглэн, 6%-һаа 31% хүрэтэр буферэй концентрацитайгаар хэгдэһэн; буфер А 0.1% FA, буфер В 0.1% FA ба 80% ACN байгаа. Шэнжэлэлгын багана 50°C-та хүдэлнэ. FAIMS-эй компенсациин хүшэлтүрэгшын ёһоор анханай файлые хубаахадаа FreeStyle (1.6-дахи хубилалта, Thermo Fisher Scientific) хэрэглэхэ.
Уураг элирүүлхэ ба тоосоолхо. Андромедын нэгэдэһэн бэдэрэлгын системые хэрэглэн, анханай мэдээсэлые MaxQuant 1.5.2.8 (https://maxquant.org/) хэрэглэн шэнжэлһэн байна. Aequorea victoria-һаа абтаһан Cre рекомбиназа ба YFP дараалалнуудһаа гадна, хулгана һургаалта протеомын каноническа дараалал ба изоформын дараалал (Proteome ID UP000000589, 2017 оной 5 һарада UniProt-һаа татаһан) пептидэй фрагментын спектрнүүдые бэдэрһэн байна. Метионинай исэлдэлгэ ба уураг N-усадхалай ацетилированиие хубилдаг хубилалтанууд болгон табиһан; цистеин карбамоил метилированиие тогтомол хубилалтанууд болгон табиһан байна. Хоол боловсруулха параметрнүүдые “тодорхой байдал” ба “трипсин/Р” гэжэ тохируулна. Уураг танихада хэрэглэгдэдэг пептидүүдэй ба бритвын пептидүүдэй эгээн бага тоо 1; онсогой пептидэй эгээн бага тоо 0. Пептидэй карта тааруулха нөхцөлд уураг таниха хурдадхал 0.01 байгаа. “Хоёрдохи пептид” гэһэн опци нээгдэһэн байна. Ондоо анханай файлнуудай хоорондо амжалтатай танихые дамжуулхын тулада “гүйдэл хоорондын тааруулга” гэһэн опци хэрэглэхэ. LFQ эгээн бага харисаанай тоо 1-ые тэмдэггүй тоосоололгодо (LFQ) хэрэглэхэ (60). LFQ эршэм хүсэн саг бүхэндэ ядахын хэрээр нэгэ генотипэй бүлэгтэ ядахын хэрээр хоёр үнэн сэнгээр шүүгдэжэ, үргэнтэй хэб маягай хубаариһаа экстраполяцилагдадаг. 0.3 ба 1.8 доошоо шэлжэхэ. LFQ дүнгүүдые шэнжэлхын тулада Perseus тоосоолхо платформа (https://maxquant.net/perseus/) ба R (https://r-project.org/) хэрэглэхэ. Дифференциальна илгарал шэнжэлэлгын тулада limma программын багтаамжаһаа хоёр талаһаа дунда зэргын t тест хэрэглэгдээ (61). Шэнжэлэлгын мэдээсэлэй шэнжэлэл ggplot, FactoMineR, factoextra, GGally ба pheatmap хэрэглэн хэгдэнэ. TMT-дэ үндэһэлһэн протеомикын мэдээсэлые MaxQuant 1.6.10.43 хубилалта хэрэглэн шэнжэлһэн байна. 2018 оной 9 һарада татажа абаһан UniProt-ай хүнэй протеомикын мэдээсэлэй санһаа түүхэй протеомикын мэдээсэлые бэдэрэгты. Шэнжэлэлгэ үйлэдбэрилэгшын үгэһэн изотопой арюун сэбэрэй заһабарилгын коэффициентые багтаадаг. Дифференциальна илгарал шэнжэлэлгын тулада R-дэхи лимма хэрэглэхэ. Анханай мэдээсэл, мэдээсэлэй сангай бэдэрэлгын дүнгүүд, мэдээсэлэй шэнжэлэлгын ажалай урсгал ба дүнгүүд булта PRIDE түншэдэй сангаар дамжуулан ProteomeXchange холбоондо PXD019690 мэдээсэлэй багтаамжын таниха тэмдэгтэй хадагалагдана.
Функциональна аннотацинууд шэнжэлэлые баяжуулна. 8 долоон хоногто мэдээсэлэй багтаамжын функциональна аннотациин нэрэ томьёогой баялигые тодорхойлхын тулада Ingenuity Pathway Analysis (QIAGEN) хэрэгсэл хэрэглэгдээ (Зураг 1). Тобшохоноор хэлэбэл, LC-MS/MS (тандем масс-спектрометри) мэдээсэлэй шэнжэлэлһээ абтаһан тоогой уураг жагсаалтые иимэ шүүгшын шалгуурнуудаар хэрэглэнэ: Mus musculus зүйл болон үндэһэн болгон шэлэгдэнэ, тиигээд ангилал 0.05 гү, али тэрэнһээ бага баяжуулгада Benjamini-гай тааруулһан P сэнгые харуулна, энэнь удха шанартай гэжэ үзэдэг. Энэ графикта тааруулһан Р сэн дээрэ үндэһэлһэн кластер бүхэндэ дээдэ табан илгаанууд харуулагдана. Олон t-тест хэрэглэн, Benjamini, Krieger, Yekutieli (Q = 5%)-ай хоёр шата шугаман үргэдхэлэй программа хэрэглэн, ангилал бүхэндэ тодорхойлогдоһон шухала кандидатнууд дээрэ саг хугасаанай уураг илгаралгын шэнжэлэл хэгдэжэ, мүр бүхэн тус тустаа шэнжэлэгдэнэ. Тогтомол SD абаха хэрэггүй.
Энэ шэнжэлэлгын дүнгүүдые хэблэгдэһэн мэдээсэлэй сантай зэргэсүүлжэ, 1-дэхи зураг дээрэ Веннэй диаграмма бүтээхэ зорилгоор бидэ тоогой уураг жагсаалтые MitoCarta 2.0 аннотацинуудтай ниилүүлээбди (24). Диаграмма бүтээхэдээ Веннэй диаграмма зураха онлайн хэрэгсэл (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/) хэрэглэхэ.
Протеомикын шэнжэлэлгын хэрэглэгдэдэг статистикын журам тухай дэлгэрэнгы мэдээсэл абахын тулада Материал ба аргануудай холбоотой хэһэгые хаража болоно. Бусад бүхы туршалганууд тухай дэлгэрэнгы мэдээсэлые таараһан домог соо олохо аргатай. Өөрөөр заагдаагүй һаа, бүхы мэдээсэлнүүд дунда зэргын ± SEM гэжэ тэмдэглэгдэнэ, бүхы статистикын шэнжэлэлнүүд GraphPad Prism 8.1.2 программын ашаар хэгдэһэн байна.
Энэ үгүүлэлэй нэмэлтэ материалнуудые http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1 харагты
Энэ хадаа Creative Commons Attribution-Non-Commercial License-эй ёһоор тараагдаһан нээлтэтэ нэбтэрхэй толи болоод энэнь ямаршье хэрэгсэлээр хэрэглэхэ, тарааха, хубилгаха боломжо олгодог, хэрбээ һүүлшын хэрэглэлгэ олзын хэрэг эрхилэлгын түлөө бэшэ, анханай бүтээл зүб байха ёһотой. Дурдалга.
Анхарал: Хуудаһанда дурадхаһан хүнтнай энэ сахим бэшэгые харуулхыень хүсэжэ байһанаа, энэнь спам бэшэ гэжэ мэдэхын тулада бидэ гансал өөрынгөө сахим хаягые үгэхыетнай гуйнабди. Бидэ ямаршье сахим хаягуудые абахагүйбди.
Энэ асуудал таанадые айлшан гү гэжэ шалгаха ба автоматаар спам эльгээхэһээ сэргийлхэ хэрэгсэл болоно.
Э. Мотори, И. Атанасов, С.М.В. Кочан, К. Фольц-Донаху, В. Сактивелу, П. Джавалиско, Н. Тони, Ж. Пуял, Н.-Г. Ларсон
Ажаллахагүй нейронуудай протеомик шэнжэлэлгын дүнгөөр ​​нейродегенерациие эсэргүүсэхэ зорилгоор бодосой солилсооной программанууд эдэбхижүүлэгдэдэг гэжэ элирүүлһэн байна.
Э. Мотори, И. Атанасов, С.М.В. Кочан, К. Фольц-Донаху, В. Сактивелу, П. Джавалиско, Н. Тони, Ж. Пуял, Н.-Г. Ларсон
Ажаллахагүй нейронуудай протеомик шэнжэлэлгын дүнгөөр ​​нейродегенерациие эсэргүүсэхэ зорилгоор бодосой солилсооной программанууд эдэбхижүүлэгдэдэг гэжэ элирүүлһэн байна.
©2020 Эрдэм ухаанай хүгжэлэй Америкын холбоо. бүхы эрхэнүүд хамгаалагдаһан. AAAS хадаа HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef болон COUNTER-эй түншэ юм. Эрдэм ухаанай дэбжэлтэ ISSN 2375-2548.