Мүнөө†Мүнөөнэй хаяг: OX11 0DE, UK, Diamond Building, Harwell Science and Innovation Park, Dietcote, Oxfordshire, UK, Diamond Light Source Co., Ltd., Electronic Biological Imaging Center.
Реакциин түбэй гэрэл суглуулха комплекс 1 (RC-LH1) ягаан үнгэтэй фототроф бактериин гол фотосинтезэй бүридүүлэгшэ юм. Бидэ Rhodopseudomonas palustris-һээ RC-LH1 комплексын хоёр криоэлектрон микроскопиин бүтэсэ нэбтэрүүлээбди. RC-LH114-W комплексын 2.65-Å нягтабариин бүтэсэ RC-ые тойроһон 14 LH1 дэд нэгэдэлэй һэлбэнһээ бүридэнэ, энэнь W уурагһаа таһардаг, харин уураг-Wгүй комплекс RC-ээр хүреэлэгдэһэн бүрин RC бүридэлтэй. LH1 дэд нэгэдэлтэй цикл хаагдаһан. Эдэ бүтэсэ зэргэсүүлгэ RC-LH1 комплексын хиноной динамика тухай ойлгосо үгэнэ, энэ тоодо RC QB газарта хиноной холбогдоходоо урид тодорхойлогдоогүй конформационно хубилалтанууд, мүн RC-дэ дамжуулхада туһалдаг хиноной холболтын туһаламжатай газарнуудай байрлалга. W уурагта онсогой бүтэсэ LH1 циклэй хаагдахаһаа сэргийлнэ, тиигэжэ хинон/хинолоной солилсоое түргэдүүлхэ сувагые бии болгодог.
Фотосинтезээр үгтэһэн эршэм хүсэн дэлхэй дээрэхи бүхы шахуу амидаралые хангажа шададаг ба энэнь наранай биотехнологидо ехэ боломжотой. Дэлхэйн фотосинтезые дэмжэхэ зуураа, ягаан үнгэтэй фототроф бактеринууд элдэб энергиин горимуудые ба бодосой солилсооной шадабаринуудые харуулдаг. Тэдэ фотосинтезһээ зайлажа, харанхыда гетеротроф бактери боложо ургадаг, азот ба нүүрһэнтүрэгшын диоксидые заһажа, уһантүрэгшэ үйлэдбэрилжэ, үнэртэй нэгэдэлнүүдые задалжа шададаг (1-3). Эдэ үйлэ ябасануудта эршэм хүсэн үгэхэ зорилгоор гэрэлые түргэн ба үрэ дүнтэйгээр химиин эршэм хүсэндэ хубилгаха хэрэгтэй. Энэ үйлэ ябаса гэрэл баридаг антеннын комплекс гэрэл шэнгээжэ, бариһан энергиие реакциин түбтэ (RC) дамжуулхада эхилдэг, тиигэжэ зарядай илгарал эхилдэг (4 – 7). Ягаан үнгэтэй фототроф бактеринуудай фотосинтезэй үндэһэн нэгэдэл 2-дохи түхэлэй RC-һээ бүридэнэ, гэрэл суглуулдаг 1-дэхи комплекс (LH1)-ээр хүреэлэгдэһэн, RC-LH1 гол комплексые бии болгодог. LH1 муруй αβ гетеродимернүүдэй массивһаа бүридэнэ, тус бүринь хоёр бактериин хлорофилл (BChl) a молекулануудые ба нэгэ гү, али хоёр каротиноидуудые (8-12) холбодог. Эгээн энгын LH1 антенна 16 гү, али 17 αβ гетеродимернүүдһээ бүридэнэ, тэдэ RC (9-13)-ые хаалтатай циклээр хүреэлнэ, харин бусад гол комплексуудта трансмембранна пептидүүд оршон тойронхи LH1-эй үргэлжэлэлые таһалдаг, тиигэжэ RC ба цитохром bc комплексын хоорондохи хинол/хинон тархалтые дэмжэдэг (111,15). Ягаан үнгэтэй фототроф ургамал Rhodopseudomonas (Rps.) хадаа фотосинтезые дэмжэхэ энерги ба электрон дамжуулалтые ойлгожо шадаха жэшээ организм юм. Rps-эй түрүүшын кристалл бүтэсэ. Palustris RC-LH1 комплексын загбар RC болоод 15 гетеродимернэ LH1 гогцоонуудаар хүреэлэгдэһэн, тэдэниие “Уураг W” гэжэ нэрэтэй мэдэгдээгүй уураг таһалдаг (14). Protein-W һүүлдэнь RPA4402 гэжэ тодорхойлогдоһон, энэнь гурбан уридшалан мэдэгдэһэн трансмембранна спиральтай (TMH) 10.5kDa шэнжэгүй уураг юм (16). W уурагые кодлодог rpa4402 геные RC-L, M (pufL, pufM) ба LH1α, β (pufA, pufB) дэд нэгэдэлнүүдые кодлодог генүүдтэ хэрэглэгдэдэг номенклатуратай тааруулан pufW гэжэ нэрлэхэ тухай дурадханабди. Һонирхолтойнь гэхэдэ, уураг-W RC-LH1-эй оройдоол 10%-да байдаг, энэнь Rps-ые элирүүлнэ. palustris хоёр ондо ондоо RC-LH1 комплекс бии болгодог. Эндэ бидэ хоёр гол комплексын үндэр нарибшалалтай крио-ЭМ (крио-ЭМ) бүтэсэ тухай мэдээсэнэбди, нэгэниинь W уурагтай ба 14 αβ гетеродимертэй, нүгөөдэнь W уураггүй ба хаалтатай 16 Гетеродимер LH1 циклтэй. Манай бүтэсэ Rps-эй RC-LH1 комплексые ойлгоходо алхам хубилалта болоно. palustris, юундэб гэхэдэ бидэ вариант бүхэнэй нэгэ түрэлэй популяциие шэнжэлжэ, пептид бүхэниие болон холбоотой пигментнүүдые болон холбоотой липидүүдые болон хинонуудые тодорхойгоор тодорхойлхо хангалтатай шиидхэбэритэй байгаабди. Эдэ бүтэсэ зэргэсүүлхэдэ, үшөө ямаршье RC-LH1 комплексдо оложо шадаагүй гурбан TMH уураг-W хинон/хинолоной солилсоое түргэдүүлхын тулада хинон канал бии болгодог гэжэ харуулна. Хэдэн хадгалагдаһан липид ба хинон холбохо газарнууд элирүүлэгдэһэн, тиигээд бидэ хинон ба RC-эй хослолой һүүлдэ шэнэ конформационно хубилалта элирүүлһэн байнабди, энэнь хүшэлтүрэгшэтэй фототроф организмуудай фотосистемын II (PSII) RC-дэ таарамжатай байжа магадгүй. Манай ололтонь ягаан үнгэтэй фототроф бактериин RC-LH1 гол комплексын хинон/хинолоной холбоо ба солилсооной кинетикын талаар шэнэ ойлгосо үгэнэ.
Rps-дэ олоһон хоёр комплексые дэлгэрэнгыгээр шэнжэлхэ зорилгоор. palustris, бидэ RC-LH1 бүхэниие биохимиин аргаар тусгаарладагбди. Уураг W-дутагдалтай комплекс (удаадахи ΔpufW гэжэ нэрлэгдэхэ) pufW генгүй штаммһаа сэбэрлэгдэһэн (16), гансал нэгэ RC-LH1 комплекс үйлэдбэрилжэ болоно. Уураг W-агуулһан комплекс штаммаар бии болодог. Энэ штаммай W уураг С-усадхалайнь 10x His тэмдэгтэйгээр хубилгагдаһан, тиимэһээ W уураг агуулһан комплекс металл хүдэлгөөнгүй болгожо ехэнхи дутагдалтай W уурагтай үрэ дүнтэйгээр ниилүүлэгдэхэ аргатай. Комплекс үрэ дүнтэйгээр тусгаарлагдана (16) Аффинит хроматографи (IMAC).
1-дэхи зураг дээрэ харуулһандал, хоёр комплекс LH1 антеннаар хүреэлэгдэһэн гурбан дэд нэгэдэлтэй RC (RC-L, RC-M ба RC-H) агуулна. Уураг-W дутаһан комплексын 2.80-A бүтэсэ 16 αβ гетеродимерые харуулна, энэнь RC-ые тойроод хаалтатай LH1 һэлбэн бии болгодог, саашадаа RC-LH116 комплекс гэжэ нэрлэгдэхэ. Уураг-W агуулһан комплексын 2.65Å бүтэсэ уураг-W-ээр таһалагдаһан 14-гетеродимер LH1-тэй, саашадаа RC-LH114-W гэжэ нэрлэгдэхэ.
(А ба В) Нэгэдэлэй гадаргуугай дүрсэлэл. (C ба D) Һэеыгээр илгаруулагдаһан холбоотой пигментнүүд. (E ба F) Цитоплазмын гадаргууһаа ажаглаһан комплексууд хүүхэлдэйн кинодо харуулһан пептидүүд ба LH1 дэд нэгэдэлнүүдтэй, уураг-W зайһаа сагай зүүгээр дугаарлагдаһан [Rba дугаарлалтатай тааруу. sphaeroides комплекс (13)]. LH1-α-да уураг дэд нэгэдэлэй үнгэ шара; LH1-β-да уураг дэд нэгэдэлэй үнгэ хүхэ; уураг-W-дэ уураг улаан; RC-H-да энэнь лазурит үнгэтэй; RC-L-дэ энэнь улбар шар; RC-M-эй түлөө, магент. Кофакторнуудые шүдэрнүүдээр тэмдэглэнэ, ногоон үнгэ BChl ба BPh a молекулануудые, ягаан үнгэ каротиноидуудые, шара үнгэ UQ10 молекулануудые тэмдэглэнэ. (G ба H) RC-LH114-W комплексын (G) ба RC-LH116 комплексын (H) тэнсүү бүһэдэ уураг-W забһарай томо болгоһон харалга. Кофакторнууд зай дүүргэлгын түхэлөөр харуулагдана, хелатированна хинон хүхэ үнгөөр ​​харуулагдана. Уураг-W забһарые (G)-дэ хүхэ зурлаагаар онсолһон, LH116 бэһэлиг дээрэ хинон/хинолол тархаһан багахан нүхэнүүдые (H)-дэ хара зурлаагаар онсолһон байна.
Зураг 1 (А ба В) LH1αβ гетеродимерэй нээлтэтэй гү, али хаалтатай массивуудаар хүреэлэгдэһэн RC-ые харуулна, тус бүри хоёр BChl ба нэгэ каротиноидые холбодог (Зураг 1, С ба D). Урдахи шэнжэлэлнүүд Rps гээшэ LH1 комплекс гэжэ харуулһан байна. Спирулин ксантинай биосинтезэй замда эдэ зүйлнүүд каротиноидуудай холимог популяцинуудые агуулдаг (17). Гэбэшье, спиропирроксантин гол каротиноид болоод нягтань хангалтатай. Тиимэһээ бидэ LH1 холбохо бүхы газарнуудта спироксантин загбарлаха гэжэ шиидэбэбди. Альфа ба бета полипептидүүд богони мембранатай гадаада бүһэтэй ганса ТМХ-нууд юм (Зураг 1, А, В, Е, ба F). С-усадхалай 17 үлэгдэлэй нягта ажаглагдаагүйшье һаа, альфа полипептид хоёр комплексдо Met1-һээ Ala46 хүрэтэр задарһан байна. β полипептид RC-LH116-да Gly4-һээ Tyr52 болотор, RC-LH114-W-дэ Ser5-һаа Tyr52 болотор багадхаһан байна. гү, али 4 N-усадхалай гү, али 13 C-усадхалай үлэгдэлнүүдэй нягта ажаглагдаагүй (Зураг S1). Зэрлиг түхэлэй штаммһаа бэлдэһэн холимог RC-LH1 комплексын масс-спектрометриин шэнжэлэл үгы болоһон бүһэ нютаг эдэ пептидүүдэй гетерологическа задаралгын үрэ дүн гэжэ харуулаа (Зураг S1 ба S2). α-Met1-эй N-усадхалай формилировани мүн лэ ажаглагдаа (f). Шэнжэлэлгын дүнгөөр ​​α-пептид fMet1-һээ Asp42/Ala46/Ala47/Ala50 хүрэтэр үлэгдэлнүүдһээ бүридэнэ, харин β-пептид Ser2-һээ Ala53 хүрэтэр үлэгдэлнүүдһээ бүридэнэ, энэнь бага температуратай ЭМ нягта картатай һайн тааруу байна.
α-His29 ба β-His36-ай зохисуулга BChls-ые нюур нюураараа болгодог; αβ гетеродимер бүхэн хүршэнэртэйгээ сугларжа, RC-ые тойроод нээлтэтэй гогцоо (RC-LH114-W) гү, али хаалтатай гогцоо (RC-LH116) бии болгодог. RC-LH114-W-эй 877 нм-эй бүһэтэй харисуулхада, RC-LH116-ай 880 нм-эй шэнгээхэ улаан шэлжэлтэ 3 нм болоно (Зураг 2А). Гэбэшье, дүхэриг дихроизмын спектр бараг адли (Зураг 2В), энэнь нээлтэтэй ба хаалтатай циклнүүдэй хоорондо тодорхой илгаа байгаашье һаа, BChls-эй нютагай оршон тон адлирхуу гэжэ харуулна. Шэнгээхэ улаан шэлжэлтэ хаалтатай цикл дээрэхи дулаанай хүдэлөөнэй бууралга ба тогтосотой байдал нэмэгдэһэн (18, 19), хаалтатай циклэй үрэ дүндэ пигмент холбооной хубилалта (20, 21) гү, али эдэ хоёр нүлөөнэй хослол (11) үрэ дүн байжа болоно.
(A) Ультраягаан/харагдаха/ойрохи инфраулаан шэнгээхэ спектр, орьёлнуудынь өөһэдынгөө таараһан пигментнүүдээр тэмдэглэгдэһэн ба 775 нм-эй BPh орьёлдо нормализацилагдаһан. (B) 805 нм-тэ BChl шэнгээхэ стандартизацилагдаһан дүхэриг дихроизмын спектр. (C ба D) RC-LH114-W комплексын (C) ба RC-LH116 комплексын (D) саг хугасаанай шэнгээхэ спектрнүүдһээ шэлэгдэһэн ΔA спектрнүүд. Һайн зэргэсүүлхын тулада бүхы спектрнүүдые 0.2 ps-дэ −A-гай ∆A-да нормализацилна. (E) UQ2-эй элдэб концентрацитай байхада туяалалгын һүүлдэ цитохром c2-эй исэлдэлтын хурдадхал (түүхэй мэдээсэлые S8 зураг харагты). (F) Бага, дунда гү, али ехэ эршэмтэй гэрэл доро (10, 30 гү, али 300μMm-2 s-1, тус тусдаа) ургуулһан эсүүдтэ сэбэрлэгдэһэн комплекс соохи уураг W ба RC-L дэд нэгэдэлнүүд ба тусгаарлагдаһан мембранай харисаа. SDS-полиакриламид гель электрофорез болон иммуноанализаар уураг хэмжээе тодорхойлхо (түүхэй мэдээсэлые S9 зураг харагты). Сэбэрлэгдэһэн RC-LH114-W комплекстой харисуулан тодорхойлхо. Комплексэй RC-L ба уураг-W-эй стехиометрическэ харисаа 1:1 байна.
RC-LH114-W-эй гажуудһан αβ14 циклэй 1-дэхи байрада байһан BChls (Зураг 1, А, С, ба Е) RC-LH116-дахи тэнсүү BChls-һээ 6.8Å-ээр RC-LH116-дахи тэнсүү BChls-һээ (Зураг 1, B, D, ба S3); гэбэшье, хоёр комплексын шэлжэлтын шэнгээхэ кинетикэ RC-LH114-W ба RC-LH116-да LH1-һээ RC хүрэтэр һэдэлгын энергиин дамжуулгын сагай тогтомол 40 ±4 ба 44±3 ps (Зураг 2) гэжэ харуулна. , C ба D, S4 зураг ба S2 таблица). Мүн RC дотор электрон дамжуулгада удха шанартай илгаа үгы (Зураг S5 ба холбоотой нэмэлтэ текст). LH1 ба RC-P хоорондохи энергиин дамжуулгын сагай нягта тааралдал LH1 хоёр циклэй ехэнхи BChl-эй адлирхуу зай, булан ба потенциальна энергиһээ болоно гэжэ бидэ һэжэглэнэбди. Эгээн бага зайда хүрэхэ LH1 энергиин хэб маягые шэнжэлхэ гээшэ оностой бэшэ газарнуудһаа RC руу энергиин шууд дамжуулгаһаа хурдан бэшэ шэнги. RC-LH114-W-дэхи нээлтэтэ циклэй LH1 цикл бүтэсэ шэнжэлэлгын тулада бага температурада удхагүй дулааны хүдэлөөндэ орожо магадгүй ба RC 1-эй байрлалай βBChls-эй пигментациин зайһаа танхимай температурада αβ14 бэһэлигэй конформаци ута байдаг.
RC-LH116 комплекс 32 BChls ба 16 каротиноидуудые агуулдаг ба тэрэнэй ниитэ зохисуулгань Thermochromatium (Tch.) pidpidum [Protein Data Bank (PDB) ID 5Y5S] (9), Thiorhodovibrio (Trv.) штамм (PDB) DB0 (IDC) (2919)-һээ абтаһантай адли. ба ногоон замаг (Blc.viridis) (PDB ID 6ET5) (10). Тэгшэлгын һүүлдэ αβ гетеродимернүүдэй байрада гансал багахан хазагайралтанууд ажаглагдаа, илангаяа 1-5, 15, 16 (Зураг S6). Уураг-W-эй байрлалга LH1-эй бүтэсэ дээрэ ехэ нүлөө үзүүлдэг. Тэрэнэй гурбан ТМХ-нууд богони гогцоонуудаар холбогдоһон, N-усадхалайнь комплексын люменэй талада, С-усадхалайнь цитоплазмын талада (Зураг 1А ба 3, А-һаа D хүрэтэр). Уураг-W ехэнхидээ гидрофоб (Зураг 3B), ба TMH2 ба TMH3 LH1αβ-14-тэй харилсан үйлэшэлжэ трансмембран гадаргуу бии болгодог (Зураг 3, B ба E-һээ G хүрэтэр). Интерфейс гол түлэб трансмембранна бүһэдэ Phe, Leu ба Val үлэгдэлнүүдһээ бүридэнэ. Эдэ үлэгдэлнүүд гидрофоб аминохүшэлнүүд болон αβ-14 пигментнүүдээр дүүрэн байдаг. Зарим полярна үлэгдэлнүүд мүн харилсан үйлэшэлэлдэ хубита оруулдаг, энэ тоодо W-Thr68 ба β-Trp42 хоорондохи уһантүрэгшын холбоо комплексын хонхор гадаргуу дээрэ (Зураг 3, F ба G). Цитоплазмын гадаргуу дээрэ Gln34 αβ-14 каротиноидуудай кето бүлэгтэй зэргэлээд байна. Нэмэжэ хэлэбэл, n-додецил β-d-мальтозид (β-DDM) молекула шиидхэгдэжэ, тэрэнэй гидрофоб һүүлынь уураг-W ба αβ-14 хоорондохи холбооһон хүрэтэр үргэдхэгдэжэ, липидэй һүүл бэедэ байрлажа магадгүй. Мүн W ба RCH уурагуудай С-усадхалай шиидхэбэриин бүһэ нютагууд тон дүтэ, зүгөөр тусхай харилсан үйлэшэлэлгэнүүдые бии болгохо хүреэндэ ородоггүй гэжэ бидэ анхарбабди (Зураг 1, А ба Е). Гэбэшье эдэ хоёр уурагуудай шиидхэгдээгүй С-усадхалай аминохүшэлнүүдтэ харилсан үйлэшэлэлгэнүүд байжа болохо, энэнь RC-LH114-W комплексын суглуулбариин үедэ уураг-W-ые татаха механизмые хангаха аргатай.
(A) Уураг-W, LH1αβ14-тэй хүүхэлдэйн киногой түхэлтэй харилсажа, һэеы хэлбэриин хажуугай гинжэтэй (улаан), энэнь электростатик потенциал диаграммын хэһэгтэ харуулагдана (0.13-ай контур түбшэндэ тунгалаг саарал гадаргуу). (B) Уураг-W гидрофоб үнгэтэй гадаргуугаар тэмдэглэгдэнэ. Туйл ба цэнэгтэй газарнууд лазурит үнгөөр, гидрофоб газарнууд сагаан үнгөөр, бата бэхи гидрофоб газарнууд улбар шар үнгөөр ​​харуулагдана. (C ба D) Уураг-W хүүхэлдэйн кинодо харуулагдана, тэрэнэй шэглэл (A) (C)-тэй адли, 180° (D) эрьюулэгдэнэ. Дараалал соохи байра һууриин ёһоор илгаруулагдаха үлэгдэлнүүд солонгос үнгын схемые абадаг, эндэ N-усадхал хүхэ, C-усадхал улаан. (E) Уураг-W (A)-тай адли харагдажа, уураг-W:LH1-эй интерфейс дээрэхи үлэгдэлнүүдые хабсарһан тэмдэгүүдтэй шүдэрнүүдээр харуулна. (F) Protein-W хүүхэлдэйн киногой дүрсэлэлдэ (E) ба LH1αβ14-тэй харисуулан 90° эрьюулэгдэнэ, ба бар дүрсэлэлдэ интерфейсын үлэгдэлнүүдтэй харисуулан. Бета полипептидһээ үлгөөтэй үлэгдэлнүүд тэмдэглэгдэһэн байна. Кофактор 1-дэхи зурагта таараха зурлаагаар харуулагдана, задарһан β-DDM саарал үнгөөр ​​харуулагдана, хүшэлтүрэгшэ улаан үнгөөр ​​харуулагдана. (G) (F)-дэхи хараса 180° эрьюулэгдэһэн, тэмдэглэгдэһэн альфа полипептидэй тодо үлэгдэлнүүдтэй.
Уураг-W αβ гетеродимерые (1F зурагта 15-дахи) һэлгэнэ, тиигэжэ циклэй хаагдахаһаа сэргийлжэ, түрүүшын гурбан αβ гетеродимерые хазайлгадаг. Түрүүшын αβ-1 гетеродимерэй эгээн ехэ налуугай булан плёнкын нормальтай харисуулхада 25°-һаа 29° хүрэтэр байгаа (Зураг 1, А ба Е), энэнь RC A хурса контраст-LH116-да αβ-1-эй 2°-һаа 8° хүрэтэр налуугаар бии болоһон (Зураг 1, В ба F). Хоёрдохи ба гурбадахи гетеродимернууд тус тусдаа 12°-һаа 22° хүрэтэр ба 5°-һаа 10° хүрэтэр налуутай. RC-эй стерическэ һаадһаа боложо, αβ-1-эй хазайлта αβ-эй хоёрдохи хосые багтаадаггүй (энэнь 1F зурагта 16-дахи αβ-тай таарана), тиимэһээ LH1 бэһэлигтэ тодорхой зай бии болгодог (Зураг 1, А ба Е) . Хоёр αβ гетеродимерэй дутагдалһаа боложо, дүрбэн BChl ба хоёр каротиноид алдагдахаһаа боложо, каротиноидуудай нэгэшье мушгирһан αβ-1 дэд нэгэдэлтэй холбогдодоггүй, энэнь 13 каротиноид Vegetarian ба 28 BChls агуулһан LH114-W бэһэлигые бии болгодог. αβ1-һээ 7 хүрэтэрхи бүһэ нютагуудта хоёр комплексын нютагай шиидхэбэриин сэгнэлтэнүүд LH1 циклэй бусад хэһэгүүдһээ бага, энэнь RC QB сайттай зэргэлээд байһан LH1 дэд нэгэдэлэй үндэһэн уян хатан байдалые харуулһан байжа болохо (Зураг 4) .
RC-LH114-W (A ба B) ба RC-LH116 (C ба D) зурагуудые адли дээдэ хараса/хажуугай хараса (A ба B) (A ба C) ба 1-дэхи зурагта хөндий гадаргууһаа харуулаа. (B ба D). Үнгэтэй түлхюурнүүд баруун тээ харуулагдана.
1:14 стехиометрическэ харисаатай ганса ондоо шэнжэтэй гол комплекс хадаа Rhodococcus sphaeroides (Rba.) RC-LH1-PufX димер (13) юм. Гэбэшье, W ба PufX уурагууд тодорхой адлирхуу бэшэ, тиимэһээ LH1 бүтэсэдээ ехэ нүлөө үзүүлдэг. PufX хадаа Rps-тэй таараха байрада RC-H дэд нэгэдэлэй (13) цитоплазмын талатай харилсан үйлэшэлдэг N-усадхалай цитоплазмын доментэй нэгэ TMH юм. palustris LH116αβ-16. PufX RC-LH1 ба цитохром bcl комплексын хоорондо хинон/хинолоной солилсооной суваг бии болгодог ба бүхы Rba-да байдаг. sphaeroides гол комплекс (13). Мономер-мономерэй интерфейс Rba-да байгаашье һаа. Sphaeroides RC-LH1-PufX димер RC-LH114-W-дэхи W уураг холбохо байрада байрлана, PufX ба уураг-W-ээр үүсхэгдэһэн зай тэнсүү байрада байна (Зураг S7A). RC-LH114-W-дэхи забһар Pseudomonas rosea LH1-эй гипотетическэ хиноной каналтай (8) тааруу, энэнь W гү, али PufX уурагтай холбоогүй пептидүүдһээ бүридэнэ (Зураг S7B). Нэмэжэ хэлэхэдэ, Blc-дэхи хиноной канал. Нэгэ γ дэд нэгэдэлые (7) хаһаһанаар бии болоһон изумруд ногоон LH1 адлирхуу байрада оршодог (Зураг S7C). Хэдыгээр ондо ондоо уурагуудаар зуучлагдаһаншье һаа, эдэ хинон/хинолол сувагуудай RC-LH1 комплексын ниитэ байрада бии болоһониинь конвергент хубисхалай жэшээ боложо, W уурагһаа бии болоһон зай хинон суваг боложо магадгүй гэжэ харуулна.
LH114-W циклэй зай RC-LH114-W комплексын дотоодо зай ба томоохон мембранай хоорондо үргэлжэлһэн мембранай бүһэ бии болгохо боломжо олгодог (Зураг 1G), харин уурагуудта адли уураг нүхэн дамжуулан хоёр доменые холбохогүй. RC-LH116 комплекс хаалтатай Tch-тэй адли. Зүү шэнги комплекс (22) (Зураг 1Н). Мембранаар дамжан хиноной тархалта нариихан уураг дамжуулан тархалтаһаа хурдан тула нээлтэтэй LH114-W цикл хаалтатай LH116 циклһээ хурдан RC эргэлтые боломжотой болгодог ба хиноной RC руу тархалта илүү хизгаарлагдамал байжа болоно. W уураг RC-ээр дамжуулан хинонуудай хубилалтада нүлөөлнэ гү гэжэ туршахын тулада бидэ тодорхой концентрацитай убихинон 2 (UQ2) (байгаалиин UQ10-ай богони изопрен һүүлтэй аналог) дээрэ цитохром исэлдэлтын шэнжэлэл хээбди (Зураг 2Е). Хэдыгээр хелатированна хиноной байрлалга илгарма Михаэлисэй тогтомолые зүбөөр тодорхойлходо һаад болодогшье һаа (RC-LH114-W ба RC-LH116 тус тусдаа 0.2±0.1μM ба 0.5±0.2μM-дэ таарамжатай), RC-LH114-W-эй эгээн ехэ хурдадхал ( 4.6±026±021-12-1-RC-RC-s-1- s-1-. RC-LH116-һаа 28±5% ехэ (3.6±0.1 e-RC-1 s-1).
Бидэ анха уураг-W гол комплексын 10% оршомдо байдаг гэжэ тоолоһон байнабди (16); эндэ бага гэрэлтэй, дунда гэрэлтэй, үндэр гэрэлтэй ургалтын эсүүдэй эзэлхэ хэмжээн тус тусдаа 15±0.6%, 11±1% ба 0.9±0.5 % (Зураг 2F). Масс-спектрометриин тоогой зэргэсүүлгэ гистидин тэмдэгэй нэмэлтэ зэрлиг түхэлэй штаммуудтай харисуулхада уураг-W-эй харисангы элбэг байдалые багадхаагүй гэжэ харуулаа (P = 0.59), тиимэһээ эдэ хэмжээнүүд хубилгагдаһан уураг-W-эй артефакт бэшэ (Зураг S10). Гэбэшье, RC-LH1 комплекс соо уураг-W-эй энэ бага эзэлхүүн зарим RC-нүүдые хурдадхаһан хурдаар һэлгэхэ боломжо олгожо, тиигэжэ RC-LH116 комплекс соо удаан хинон/хинолоной солилсоое намдааха аргатай. Гэрэлэй үндэр эзэлхүүнэй хэмжээн һаяын транскриптомикын мэдээнүүдтэй таарахагүй гэжэ бидэ анхарбабди, энэнь pufW генэй илгарал шанга гэрэл доро нэмэгдэдэг гэжэ харуулна (Зураг S11) (23). pufW транскрипци ба RC-LH1 комплексдо уураг-W нэбтэрүүлгын хоорондохи илгаа эндүүрэлтэй болоод уураг комплексын зохисуулалтые харуулһан байжа магадгүй.
RC-LH114-W-дэ 6 кардиолипин (CDL), 7 фосфатидилхолин (POPC), 1 фосфатидилглицерол (POPG) ба 29 β-DDM молекулануудые хубаажа, тэрээн соо 6 CDL, 24 POPC, 2 POPG ба 12 DMD-ые загбарлаһан байна. RC-LH116 (Зураг 5, А ба В). Эдэ хоёр бүтэсэ соо CDL комплексын цитоплазмын талада шахуу байрлана, харин POPC, POPG ба β-DDM ехэнхидээ люминальна талада байрлана. RC-LH114-W комплексын αβ-1-һээ αβ-6 хүрэтэр бүһэдэ хоёр липид ба угаалгын молекула тусгаарлагдаһан (Зураг 5А), табаниинь RC-LH116-тай адли бүһэдэ тусгаарлагдаһан (Зураг 5В). Комплексэй нүгөө талада үлүү олон липидүүд, гол түлэб CDL, RC ба αβ-7 хоорондо αβ-13 хүрэтэр сугларһан байна (Зураг 5, А ба В). Бусад бүтэсэтэйгээр шиидхэгдэһэн липидүүд ба угаалгын бодосууд LH1 бэһэлигэй газаа байрладаг ба һайн шиидхэгдэһэн ацил гинжэнүүд LH1 дэд нэгэдэлнүүдэй хоорондо үргэлжэлдэг, RC-LH114-W-дэ β-DDM гэжэ уридшалан тэмдэглэгдэнэ, RC A-да β-DDM ба PO-LH166 холисо соо β-DDM гэжэ тодорхойлогдоно. Манай бүтэсэ соохи хелатировалһан липидүүдэй ба угаалгын бодосуудай адлирхуу байра һууринь тэдэнэй физиологиин талаар холбоотой холбооной газарнууд гэжэ харуулна (Зураг S12A). Tch-дэхи эквивалент молекулануудай байра һууринь баһал һайн нягта холбоотой. Зөөлэн ба Трв. 970 штамм RC-LH1s (Зураг S12, B-һээ E хүрэтэр) (9, 12) ба липидэй толгойн бүлэгэй уһантүрэгшын холбооной үлэгдэлнүүд дараалал тэгшэлгэдэ нилээд һайн хадгалагдаһан байна (Зураг S13), энэнь RC-тэй холбогдодог хадгалагдаһан CDL (24), эдэ газарнууд RCH-LH1 комплексдо хадгалагдажа болохо гэжэ харуулна.
(A ба B) RC-LH114-W (A) ба RC-LH116 (B) пептидүүдые хүүхэлдэйн кинонуудаар харуулаа, харин пигментнүүдые 1-дэхи зураг дээрэхи үнгын схемые хэрэглэн, шүдэрнүүдээр харуулна. Липидүүдые улаан үнгөөр, угаалгын бодосуудые саарал үнгөөр ​​харуулаа. RC QA ба QB сайтнуудтай холбоотой UQ шара үнгэтэй, харин тусгаарлагдаһан UQ хүхэ үнгэтэй. (C ба D) (A) ба (B)-тай адли үзэл бодолнууд, липидүүдые орхиһон. (E to G) RC-LH116-һаа Q1(E), Q2(F) ба Q3(G)-эй томо болгогдоһон харалга, бэе бэедээ нүлөөлдэг хажуугай гинжэнүүдтэй. Уһантүрэгшын холбоонуудые хара зурлаануудаар харуулаа.
RC-LH116-да заряд илгаруулха үйлэ ябасада электрон дамжуулгада хабаададаг RC QA ба QB UQ хоюулаа холбооһоной газартаа задардаг. Гэбэшье, RC-LH114-W-дэ QB хинон шиидхэгдээгүй, доро дэлгэрэнгыгээр хэлсэгдэхэ. QA ба QB хинонуудһаа гадна, хоёр хелатированна UQ молекуланууд (RC ба LH1 бэһэлигүүдэй хоорондо оршодог) RC-LH114-W бүтэсэ соо һайн шиидхэгдэһэн толгойн бүлэгүүдэй ёһоор хубаагдана (тус тусдаа Q1 ба Q2-до байрлана). сансар). Зураг 5С). Q1-дэ хоёр изопренэй нэгэдэл үгтэнэ, нягта карта Q2-эй 10 изопренэй һүүлнүүдые шиидхэнэ. RC-LH116-ай бүтэсэ соо гурбан хелатированна UQ10 молекуланууд (Q1-һээ Q3 хүрэтэр, 5D зураг) шиидхэгдэһэн, бүхы молекуланууд һүүлээрнь тодорхой нягтатай (Зураг 5, D-һээ G хүрэтэр). Хоёр бүтэсэ соо Q1 ба Q2-ой хиноной толгойн бүлэгүүдэй байра һууринууд тон һайн нягта холбоотой (Зураг S12F), тиигээд тэдэ гансал RC-тэй харилсан үйлэшэлдэг. Q1 RC-LH114-W-эй W забһарай үүдэндэ оршодог (Зураг 1G ба 5, C, D ба E), Q2 QB холбохо газарай ойролсоо (Зураг 5, C, D) ба F). Хадагалагдаһан L-Trp143 ба L-Trp269 үлэгдэлнүүд Q1 ба Q2-до тон дүтэ ба π-стакинг харилсан үйлэшэлэлгэ боломжотой (Зураг 5, E ба F, ба Зураг S12). L-Gln88, Q1-эй холын хүшэлтүрэгшэһөө 3.0 Å, бата бэхи уһантүрэгшын холбоо үгэнэ (Зураг 5Е); энэ үлэгдэл эгээл холын харилсаанһаа бусад бүхы RC-нүүдтэ хадагалагдана (Зураг S13). L-Ser91 бусад ехэнхи RC-нүүдтэ Thr-ээр консервативна аргаар һэлгэгдэдэг (Зураг S13), Q1-эй метил хүшэлтүрэгшэһөө 3.8 Ангстром зайтай, ба сула уһантүрэгшын холбоо үгэжэ магадгүй (Зураг 5E). Q3 тусхай харилсан үйлэшэлэлгэгүй шэнги, харин RC-M дэд нэгэдэл ба LH1-α дэд нэгэдэл 5-һаа 6 хүрэтэрхи гидрофоб бүһэдэ оршодог (Зураг 5, D ба G). Q1, Q2 ба Q3 гү, али ойро оршохо хелатированна хинонууд мүн лэ Tch-дэ шиидхэгдэһэн байна. Зөөлэн, Трв. 970 штамм ба Blc. Ирисын бүтэсэ (9, 10, 12) RC-LH1 комплексын хадгалагдаһан туһаламжатай хинон холбохо газарые харуулна (Зураг S12G). RC-LH116-дахи табан задарһан UQ-нууд үндэр гүйсэдхэлтэй шэнгэн хроматографиин (HPLC) аргаар тодорхойлһон комплекс бүхэнэй 5.8±0.7-тай һайн тааруу, харин RC-LH114-W-дэхи гурбан задарһан UQ-нууд 6.2±0.3 (Зураг S14)-эй хэмжэгдэһэн сэнһээ бага байна. байгуулга.
Псевдо-тэгшэ хэмтэй L ба M полипептидүүд тус бүри табан TMH-ые агуулдаг ба нэгэ BChl димер, хоёр BChl мономер, хоёр бактериофаг (BPh) мономер, нэгэ гем бэшэ түмэр ба нэгэ гү, али хоёр UQ10 молекулануудые нэгэдхэһэн гетеродимер бии болгодог. Түгэсхэлэй кетон бүлэгтэ уһантүрэгшын холбоонууд болон Rps-дэ мэдэгдэһэн хуримталалһаа боложо каротиноидууд M-дэд нэгэдэлдэ ородог, энэнь cis-3,4-dehydroorhodopin гэжэ нэрэтэй. Зүйлнүүд (25). RC-H-эй гадаада мембранай домен нэгэ TMH-ээр мембранада зангидаһан байдаг. Ниитэ RC бүтэсэнь холбоотой зүйлнүүдэй (жэшээнь, Rba) гурбан дэд нэгэдэлэй RC-тэй адлирхуу. sphaeroides (PDB ID: 3I4D). BChl ба BPh-эй макроциклнүүд, каротиноид нюрган ба гем бэшэ түмэр эдэ бүтэсэнүүдэй илгаралгын диапазондо дабхардадаг, тиихэдэ QA-гай газарта UQ10 толгойн бүлэг ба RC-LH116-да QB хинон (Зураг S15).
QB сайтын ондо ондоо эзэлхүүнэй хэмжээтэй хоёр RC бүтэсэтэй байһаниинь QB хиноной холбоонтой хамта үргэлжэлһэн конформационно хубилалтануудые шэнжэлхэ шэнэ арга боломжо олгоно. RC-LH116 комплекс соо QB хинон дүүрэн холбоотой “проксимальна” байрлалай (26) байрлана, харин RC-LH114-W-эй тусгаарлалтада QB хинон үгы. RC-LH114-W-дэ QB хинон үгы, энэнь гайхалтай, юундэб гэхэдэ комплекс эдэбхитэй, бүтэсэтэйгээр шиидхэгдэһэн QB хинонтой RC-LH116 комплексһоо үлүү. Хоёр LH1 бэһэлигүүд зургаан оршом хинон хелатировалнашье һаа, табаниинь хаалтатай RC-LH116 бэһэлигтэ бүтэсэтэйгээр шиидхэгдэдэг, харин оройдоол гурбаниинь нээлтэтэй RC-LH114-W бэһэлигтэ бүтэсэтэйгээр хизаарлагдадаг. Энэ нэмэгдэһэн бүтэсэ эмгэг RC-LH114-W QB сайтнуудай хурдан һэлгэлтэ, комплексын хурдан хиноной кинетик, LH1 циклые гаталха магадлал нэмэгдэһэниие харуулһан байжа магадгүй. RC-LH114-W-эй RC QB газарта UQ дутагдал үлүү орёо ба эдэбхитэй комплексын үрэ дүн байжа болохо гэжэ бидэ дурадханабди, тиигээд RC-LH114-W-эй QB газар UQ эргэлтэ соо дары хүлдэһэн байна. Тодорхой шата (QB газарта орохо үүдэ хаагдаһан) энэ эдэбхитэй байдалые харуулна.
QB үгы һаа, L-Phe217-эй дахуулһан эргэлтэ UQ10-тай таарахагүй байрада, юундэб гэхэдэ энэнь һүүлэй түрүүшын изопренэй нэгэдэлтэй орон зайн зүрилдөөн үүсхэхэ (Зураг 6А). Нэмэжэ хэлэхэдэ, эли тодо гол конформационно хубилалтанууд эли, илангаяа спираль de (TMH D ба E хоорондохи циклэй богони спираль) эндэ L-Phe217 QB холбооһоной хармаанда шэлжэнэ ба L-Tyr223-ай эргэлтэ (Зураг 6А) M-A4-тэй уһантүрэгшын холбоо таһалха ба QB холбооһоной хүрээе хааха газар (Зураг 6В). Спирал де һууридаа эргэдэг, L-Ser209-эй Cα 0.33Å-ээр шэлжэнэ, харин L-Val221Cα 3.52Å-ээр шэлжэнэ. TMH D ба E-дэ ажаглагдахаар хубилалтанууд үгы, эдэ хоёр бүтэсэ соо дабхарлагдадаг (Зураг 6А). Бидэнэй мэдэһээр, энэ хадаа QB газарые хаадаг байгаалиин RC-дэхи түрүүшын бүтэсэ юм. Бүрин (QB-холбоотой) бүтэсэтэй зэргэсүүлхэдэ, хинон багадхахаһаа урид хинон руу орохын тулада конформациин хубилалта хэрэгтэй гэжэ харуулна. L-Phe217 эргэлдэжэ, хиноной толгойн бүлэгтэй π-стакинг харилсан үйлэшэлэлгэ бии болгодог ба спираль гадаада тээшээ шэлжэжэ, L-Gly222-эй араг яһан ба L-Tyr223-ай хажуугай гинжэдэ тогтвортой уһантүрэгшын холбооной бүтэсэтэй уһантүрэгшын холбооной сүлжээ бии болгодог (Зураг 6, А ба С).
(A) Голограммын (L гинжэ, улбар шар/M гинжэ, магент) ба апо (саарал) бүтэсэтэй дабхарлаһан мультфильм, эндэ гол үлэгдэлнүүдые шүдэр шэнги дүрсэлэлтэйгээр харуулна. UQ10 шара зурлаагаар харуулагдана. Точкотой зурлаа бүхы бүтэсэ соо бии болоһон уһантүрэгшын холбоонуудые харуулна. (B ба C) Аполипопротеинай гадаргуугай дүрсэлэл ба бүхы бэһэлигэй бүтэсэ, L-Phe217-ай хажуугай гинжын хүшэлтүрэгшые хүхэ үнгөөр ​​ба L-Tyr223-ай улаан үнгөөр ​​онсолон харуулһан. L дэд нэгэдэл улбар шар үнгэтэй; М ба Н дэд нэгэдэлнүүд үнгэтэ бэшэ. (D ба E) Аполипопротеин (D) ба бүхэли (E) RC QB газарнууд [үнгэ (A) тус тусдаа] ба Thermophilus thermophilus PSII (ногоон, хүхэ пластик хинонтой; PDB ID: 3WU2) Тэгшэлхэ (58).
Хүлеэгдээгүйгөөр, LH1-гүй QB-дутагдалтай RC-эй хэд хэдэн бүтэсэ биишье һаа, энэ шэнжэлэлгын үедэ ажаглагдаһан конформационно хубилалтанууд урид мэдээсэгдээгүй байгаа. Тэрэ тоодо Blc-һээ QB-эй үгы болохо бүтэсэ. виридис (PDB ID: 3PRC) (27), Tch. тепидум (PDB ID: 1EYS) (28) ба Rba. sphaeroides (PDB ID: 1OGV) (29), эдэ бүгэдэ ниитэ QB бүтэсэтэйнь бараг адли. 3PRC-ые нягтаар шалгахада LDAO (Lauryl Dimethyl Amine Oxide) угаалгын бодосой молекуланууд QB байра һууриин үүдэндэ холбогдодог, энэнь хаалтатай конформацида дахин зохисуулагдахаһаа сэргийлжэ магадгүй. LDAO 1EYS гү, али 1OGV-дэ нэгэ байрада задардаггүйшье һаа, эдэ RC-нүүдые нэгэ угаалгын бодос хэрэглэн бэлдэдэг тула адли нүлөө үзүүлжэ магадгүй. Rba-гай кристалл бүтэсэ. Цитохром c2 (PDB ID: 1L9B)-тай хамта кристаллизацилагдаһан Sphaeroides RC мүн лэ хаалтатай QB газартай шэнги. Гэбэшье, энэ ушарта RC-M полипептидэй N-усадхалай бүһэ (Q спираль дээрэхи Tyr үлэгдэлэй H холбоогоор QB холбохо газартай харилсан үйлэшэлдэг) байгаалиин бэшэ конформаци абадаг ба QB конформациин хубилалта саашадаа шэнжэлэгдэдэггүй (30 ). Юун найдамтайб гэхэдэ, бидэ RC-LH114-W бүтэсэ соо M полипептидэй иимэ гажуудал хараагүйбди, энэнь RC-LH116 RC-эй N-усадхалай бүһэтэй бараг адли. Мүн угаалгын бодос дээрэ һуурилһан LH1 антенна усадхаһанай һүүлдэ PDB-дэхи аполипопротеинай RC-нүүд шиидхэгдэһэн, энэнь RC ба оршон тойронхи LH1 бэһэлигэй дотоодо гадаргуугай хоорондохи зай соохи дотоодо хиноной нөөсэ ба липидүүдые усадхаһан гэжэ тэмдэглэхэ хэрэгтэй (31, 32). RC ажаллаха үүргэтэй, юундэб гэхэдэ энэнь задардаг QB хинонһоо бусад бүхы кофакторнуудые хадгалдаг, энэнь тогтворгүй, бэлдэлгын үедэ ехэнхидээ алдагдадаг (33). Нэмэжэ хэлэхэдэ, LH1 ба байгаалиин циклэй липидүүдые RC-һээ зайлаха нь зарядаар тусгаарлагдаһан P+QB-байдалай богони болгоһон амидаралай хугасаа гэхэ мэтэ үйлэ ажаллалгада нүлөөлхэ аргатай гэжэ мэдээжэ (31, 34, 35). Тиимэһээ, бидэ RC-ые тойроһон нютагай LH1 бэһэлигэй оршон байдал “хаалтатай” QB-эй газарые хадгалжа, тиигэжэ QB-эй ойролсоо нютагай оршон тойронхиие хадгалжа магадгүй гэжэ таамаглажа байнабди.
Хэдыгээр аполипопротеин (QB хинонгүй) ба бүрин бүтэсэнь QB газарай эргэлтын гансал хоёр зураглалые харуулдагшье һаа, хэд хэдэн үйлэ ябадалай бэшэ, харин холбоое гидрохиноноор дахин холбохоһоо сэргийлхын тулада хаалга хэжэ болохо гэһэн тэмдэгүүд бии. Аполипопротеинай QB газарай ойролсоо хинолол ба хиноной харилсан үйлэшэлэлгэ ондо ондоо байжа болохо, энэнь RC-ээр үгы болгоходо хүргэдэг. Конформациин хубилалтанууд хинонуудые холбохо ба бууруулха үүргэтэй гэжэ удаан хугасаанай туршада дурадхагдаһан байна. Хүлдэһэн RC-нүүдэй харанхыда дасан зохицоһоной һүүлдэ хинонуудые бага болгохо шадабаринь буурһан байна (36); Рентген кристаллографиин дүнгөөр ​​энэ хохидол QB хинонуудай эдэбхитэй проксимальна байраһаа 4.5 Å тухай “дистальна” конформацида хаагдаһанһаа болоно (26) , 37). Энэ холын холбооной конформацинь аполипопротеин ба дүүрэн бэһэлигэй бүтэсэ хоорондын дундажа байдалай зураглал гэжэ бидэ дурадханабди, энэнь хинонтой анханай харилсан үйлэшэлэлгэ болон QB сайтын нээлтэһээ хойшо болодог.
Зарим фототроф бактеринууд болон цианобактеринууд, замагууд болон ургамалнуудай PSII комплекс соо олоһон II түхэлэй RC бүтэсэ болон үйлэ ажаллалгын хамгаалалгатай (38). 6-дахи зураг дээрэ харуулһан бүтэсэ (D ба E) PSII RCs ба бактериин RC комплексын QB газарай хоорондохи адлирхуу байдалые онсолон тэмдэглэнэ. Энэ зэргэсүүлгэ удаан хугасаанай туршада хинон холбохо ба һэргээхэ нягта холбоотой системэнүүдые шэнжэлхэ загбар болоһон байна. Урданай хэблэлнүүдтэ конформациин хубилалтанууд хинонуудай PSII бууралтатай хамта болодог гэжэ дурадхаһан байна (39, 40). Тиимэһээ, RC-эй хубисхалай хадгалалтые хаража үзэхэдэ, энэ урид ажаглагдаагүй холбооной механизмые хүшэлтүрэгшэтэй фототроф ургамалнуудта PSII RC-эй QB газарта хэрэглэжэ болохо.
Rps ΔpufW (тэмдэггүй pufW усадхал) ба PufW-His (C-усадхалай 10x His-тэмдэгтэй уураг-W байгаалиин pufW локусһаа илгаруулһан) штаммууд. palustris CGA009 манай урданай ажалда (16) тодорхойлогдоһон байгаа. Эдэ штаммууд болон изогеннэ зэрлиг түхэлэй эхэ эсые PYE (тус бүри 5 г литр -1) (LB-дэ -80 °C-та хадагалагдаһан, 50% ( w/v) глицерин агуулһан) уураг, мёдной экстракт ба сукцинат) агар [1.5%/v) табаг дээрэ үсөөн тооной эсүүдые зуража хүлдөөгшэһөө абаһан байна. Хабтагайе анаэробно байдалда танхимай температурада харанхыда һүниин туршада инкубаци хэжэ, удаань OSRAM 116-W галоген лампануудаар (RS Components, UK) 3-һаа 5 хоногой туршада нэгэ колони бии болотор сагаан гэрэлээр (~50 μmolm-2 s-1) гэрэлтүүлээ. Нэгэ колони 10 мл M22+ оршон (41) 0.1% (w/v) касамин хүшэлтүрэгшэтэй (удаадахи M22 гэжэ нэрлэгдэхэ) нэмэгдэһэн тарилгада хэрэглэгдээ. Соёлые 34°C-та харанхыда 180 эргэлтээр 48 часай туршада хүдэлгэжэ, хүшэлтүрэгшын багатай байдалда ургуулжа, удаань 70 мл соёлые 24 часай туршада адли байдалда таряа. мл-эй эзэлхүүнтэй хахад аэроб соёлые 30 мл-эй универсальна шургуулгатай тунгалаг шэл лонходо 30 мл М22 оршон таряалан, 48 часай туршада ариун соронзон хүсөөр хүдэлгэжэ (~50μmolm-2 s-1) туяалуулһан байна. Удаань 30 мл культурые 1 литр оршом культуроор адли нөхцөлд таряалан, энэнь 72 часай туршада ~200 μmolm-2 s-1 гэрэлтүүлһэн 9 литр оршом культурые тарилгада хэрэглэбэ. Эсүүдые 7132 RCF-дэ 30 минутын туршада центрифугировалжа, ~10 мл 20 мМ трис-HCl (рН 8.0)-да дахин суспендироваад, хэрэгтэй болотор -20°C-та хадагалһан байна.
Хайлуулһанай һүүлдэ, һэргээгдэһэн эсүүдтэ дезоксирибонуклеаза I (Merck, UK), лизоцим (Merck, UK) ба хоёр Roche голофермент протеаза дарангылагшын таблеткэ (Merck, UK)-эй зарим кристаллнуудые нэмэхэ. 20,000 psi Франциин даралтын эстэ (Аминко, АНУ) эсүүд 8-һаа 12 дахин таһарһан байна. Таһараагүй эсүүдые ба уһалдаггүй хог хаягдалые 18,500 RCF-тэ 4°C-та 15 минутын туршада центрифугировалжа зайлуулһанай удаа, мембраные 43,000°C-та 2 часай туршада 113,000 RCF-тэ центрифугировалжа пигментированна лизатһаа тунаһан байна. Уһалдаг фракциие хаяад, үнгэтэ мембраные 100-һаа 200 мл хүрэтэр 20 мМ трис-HCl (рН 8.0) соо дахин суспендироваад, харагдаха агрегатууд үгы болотор гомогенизацилха. Суспендироваһан мембрана 20 мМ tris-HCl (pH 8.0) (Anatrace, USA) агуулһан 2% (w/v) β-DDM-дэ 1 часай туршада 4°C-та харанхыда зөөлэнөөр хүдэлгэжэ инкубаци хэгдэһэн байна. Удаань 70°C-та центрифугировалжа 150,000 RCF-ые 4°C-та 1 часай туршада уһалжа, үлэгдэл уһалдаггүй бодосуудые зайлуулха.
ΔpufW штаммай уһалдаг мембрана 50 мл DEAE Sepharose ион солилсооной колонкодо гурбан колонкын эзэлхүүнтэй (CV) холбохо буфертэй [20 мМ tris-HCl (pH 8.0) 0.03% (w / v) β-DDM] агуулһан байна. Колонко хоёр CV холбохо буферээр угаагаад, удаань 50 мМ NaCl агуулһан хоёр холбохо буферээр колонко угааха. RC-LH116 комплексые 150-һаа 300 мМ NaCl (холбооһоной буфер соо) шугаман градиентээр 1.75 CV дээрэ элюировалһан, үлэһэн холболгын комплексые 0.5 CV дээрэ 300 мМ NaCl агуулһан холболгын буферээр элюировалһан. 250-1000 нм хоорондохи шэнгээхэ спектр суглуулаад, 1-һээ ехэ шэнгээхэ харисаатай (A880/A280) фракциие 880-һаа 280 нм хүрэтэр байлгажа, холбохо буфер соо хоёр дахин шэлжүүлжэ, сэбэрлэлгын үедэ DEAE колонко дээрэ дахин адли журам хэрэглэхэ. A880/A280 харисаа 1.7-һоо дээшэ ба A880/A805 харисаа 3.0-һаа дээшэ фракцинуудые шэлжүүлжэ, ион солилсооной гурбадахи шата хэжэ, A880/A280 харисаа 2.2-һоо дээшэ ба A880/A805 харисаа 5.0.0-һаа дээшэ фракцинуудые үлөөхэ. Хэсүүгээр арюудхагдаһан комплексые Amicon 100,000 молекулярна шэгнүүрэй тайралтатай (MWCO) центрифуг шүүгшэ (Merck, UK) соо ~2 мл хүрэтэр концентрировалжа, 200 мМ NaCl агуулһан Superdex 200 16/600 хэмжээнэй хасагдаха колонкодо (GE Healthcare, US) ашаглажа, удаань тэрэл буфертэ шүүһэн байна. CV. Хэмжээе хасаха фракциин шэнгээхэ спектрнүүдые суглуулжа, 2.4-һээ дээшэ A880/A280 харисаагаар ба 5.8-һаа 100 A880 хүрэтэр A880/A805 харисаагаар шэнгээхэ спектрнүүдые түблэрүүлжэ, дары түргэн крио-ТЭМ тор бэлдэхэ гү, али хадагалхада хэрэглэхэ хэрэгтэй -80°C температурада байлгаха.
PufW-His штаммай уһалдаг мембрана 20 мл HisPrep FF Ni-NTA Sepharose колонкодо (20 мМ tris-HCl (pH 8.0) 200 мМ NaCl ба 0.03% (w/w)) IMAC буфертэ (GE Healthcare) хэрэглэбэ. v) β-DDM]. Колонко табан CV IMAC буферээр, удаань 10 мМ гистидин агуулһан табан CV IMAC буферээр угаагдаа. Гол комплексые 100 мМ гистидин агуулһан табан IMAC буферээр колонкоһоо элюулһэн байна. RC-LH114-W комплекс агуулһан фракциие Amicon 100,000 MWCO шүүгшэтэй (Merck, UK) хүдэлгэгдэһэн танк соо ~10 мл хүрэтэр концентрировалжа, холбохо буферээр 20 дахин шэлжүүлжэ, удаань 25 мл хүрэтэр нэмэнэ. Колонкые дүрбэн CV холбохо буферээр угаагаад, удаань комплексые найман CV дээрэ 0-һоо 100 мМ NaCl (холбохо буфер соо) шугаман градиентээр элюировална, үлэһэн дүрбэн CV-ые 100 мМ холбохо буфертэй. A880/A805 харисаа 4.6-һаа дээшэ фракцинуудые Amicon 100,000 MWCO центрифуг шүүгшэдэ ~2 мл хүрэтэр концентрировалжа, уридшалан 1.5 CV IMAC-ээр дүүргээд, Superdex 200 16/600 хэмжээнэй буферээр тэнсүүлһэн, удаань тэрэл буфер соо 15 CV-һээ дээшэ элюировалһан байна. Хэмжээгүй фракцинуудай шэнгээхэ спектрнүүдые суглуулжа, 2.1-һээ дээшэ A880/A280 харисаагаар ба 4.6-һаа 100 A880 хүрэтэр A880/A805 харисаагаар шэнгээхэ спектрнүүдые түблэрүүлхэ, эдэниие хүлдэһэн ТЭМ-эй тор бэлдэхэ гү, али -80°C хэрэгтэй болотор хадагалха хэрэгтэй.
Бага температуратай ТЭМ торнуудые бэлдэхэдээ Leica EM GP шэнгээхэ хүлдөөгшэ хэрэглэгдээ. Комплексые IMAC буфер соо 50-ай A880 хүрэтэр шэлжүүлһэн, удаань 5μl-ые шэнээр гэрэлтэдэг QUANTIFOIL 1.2/1.3 нүүрһэнтүрэгшын бүрхөөлтэй зэд тор дээрэ (Agar Scientific, UK) ашаглаһан. Торые 20°C ба 60% харисангы чийгшэлтэй 30 секундын туршада инкубаци хэжэ, 3 секундын туршада хатаажа, -176°C-та шэнгэн этан соо унтарааха.
RC-LH114-W комплексын мэдээсэлые eBIC (Electronic Bioimaging Center) (British Diamond Light Source) дээрэ Titan Krios микроскопоор тэмдэглэбэ, энэнь 300 кВ хурдасатай хүшэлтүрэгшэтэй, 130,000× нэрлэмэл томошуулалтатай, 2000 eV Choo-see энергиин зайтайгаар хүдэлдэг. Мэдээсэл суглуулхын тулада тоололгын горимоор зурагуудые бэшэхын тулада K2 орьёлой илгаруулагшатай Gatan 968 GIF Quantum хэрэглэгдээ. Шалгаһан пиксельэй хэмжээ 1.048Å, тунгай хурдадхал 3.83 e-Å-2s-1. Кино 11 секундын туршада суглуулжа, 40 хубида хубаагаа. Нүүрһэнтүрэгшын бүрхөөлтэй газарые хэрэглэн микроскопые дахин фокусировалжа, нүхэн бүхэндэ гурбан кино суглуулха. Бүхыдөө 3130 кино суглуулагдаһан, -1 ба -3μm хоорондохи дефокусын сэнтэй.
RC-LH116 комплексын мэдээсэлые Астербериин биоструктурын лабораторидо (Лидсын ехэ һургуули, Ехэ Британи) адли микроскоп хэрэглэн суглуулаа. Мэдээллые 130 к томошуулһан тоололгын горимоор суглуулаа, пиксельэй хэмжээе 4.6 e-Å-2s-1 тунгаар 1.065 Å хүрэтэр шалгаһан байна. Энэ кино 12 секундын туршада буулгагдажа, 48 хубида хубаагдаа. Бүхыдөө 3359 пленкэ суглуулагдаһан, -1 ба -3μm хоорондохи дефокусын сэнтэй.
Бүхы мэдээсэлэй болбосоруулалта Relion 3.0 дамжуулгын шугамаар (42) хэгдэнэ. Motioncorr 2 (43) хэрэглэн, тунгай шэгнүүрээр гэрэлэй хүдэлөөниие заһаха, удаань CTFFIND 4.1 (44) хэрэглэн CTF (контраст дамжуулха функци) параметр тодорхойлхо. Эдэ анханай болбосоруулгын шатануудай һүүлдэхи еһотой фотомикрографуудые 2-дохи зураг дээрэ харуулаа. S16. Автомат шэлэхэ загбар 250 пиксельтэй хүрээ соо 1000 хэһэгүүдэй 250 оршом пиксель гараар шэлэжэ, хоёр хэмжээнэй (2D) ангилалгүй, тиигэжэ дээжэ бузаралгатай гү, али илгарха шэнжэгүй ангилалнуудые үгы болгодог. Удаань бүхы микрофотографинууд дээрэ автомат шэлэн абалга хэгдээ, RC-LH114-W 849,359 хэһэгүүд, RC-LH116 комплекс 476,547 хэһэгүүд байгаа. Бүхы шэлэгдэhэн хэһэгүүд 2D ангилалгын хоёр шата гараһан, тиигээд гүйдэл бүхэнэй һүүлдэ нүүрһэнтүрэгшын талмай, дээжын бузаралга, эли тодо шэнжэгүй гү, али бата бэхеэр дабхарлаһан хэһэгүүдые үгы болгоһон, үрэ дүндэ 772,033 (90.9%) ба 359,678 (75.5) хэһэгүүдые 3D ангилалгын хэһэгүүдтэ хэрэглэһэн байна. RC-LH114-W ба RC-LH116 тус тус. Анханай 3D һургаалта загбарые стохастическа градиент бууралгын аргаар бүтээгээ. Анханай загбарые һургаал болгон хэрэглэжэ, шэлэгдэһэн хэһэгүүдые 3D-дэ дүрбэн бүлэгтэ хубаана. Энэ ангилал соохи загбарые һургаал болгон хэрэглэжэ, эгээл томо ангилал соохи хэһэгүүд дээрэ 3D болбосоруулалта хэхэ, удаань анханай 15Å бага дамжуулгын шүүгшэ хэрэглэн уһалагшын талмайе хушаад, 6 пиксель зөөлэн ирмэгые нэмэжэ, пиксельнүүдые һүүлшын болбосоруулан, дээдэ илгаруулагшын Gatan K2 орьёлой Модуляци дамжуулха функциие заһаха. RC-LH114-W мэдээсэлэй багтаамжын түлөө энэ анханай загбарые масканай захада (UCSF Chimera-да гол комплексын нягтаһаа таһарһан) шанга нягтые усадхажа хубилгаа. Үрэ дүнтэй загбарнуудые (RC-LH114-W ба RC-LH116-ай нягтабари тус тусдаа 3.91 ба 4.16 Å) 3D ангилалгын хоёрдохи шатада һургаал болгон хэрэглэнэ. Хэрэглэгдэһэн хэһэгүүд анханай 3D ангида бүлэглэгдэһэн ба хүршэтэй бата бэхи холбоогүй. Дабхарлалта гү, али эли тодо бүтэсэ шэнжэнүүдэй дутагдал. 3D ангилалгын хоёрдохи шата һүүлдэ эгээл үндэр нягтабаритай ангилал шэлэгдэбэ [RC-LH114-W-дэ нэгэ ангилал 377,703 хэһэгүүд (44.5%), RC-LH116-да хоёр ангилал бии, ниитэдээ 260,752 хэһэгүүд (54.7% Wh%), гансал һүүлдэ адли тэгшэлэгдэһэн байхада багахан илгаатай анханай эргэлтэ]. Шэлэгдэhэн хэһэгүүдые 400 пиксельтэй хайрсаг соо дахин гаргажа абаад, 3D болбосоруулха аргаар болбосоруулна. Уһалдаг маска анханай 15Å бага дамжуулгын шүүгшэ, 3 пиксель картын үргэдхэл ба 3 пиксель зөөлэн маска хэрэглэн бүтээгдэһэн байна. Бөөм бүриин CTF нарижуулга, хэһэг бүриин хүдэлөөнэй заһабари болон хэһэг бүриин CTF нарижуулгын хоёрдохи шата хэрэглэн, 3D нарижуулга, уһалагшын маскировко ба һүүлшын болбосоруулалта алхам бүхэнэй һүүлдэ үрэ дүнтэй бүтэсые улам нарижуулхын тулада хэгдэнэ. FSC (Fourier Shell Correlation Coefficient) 0.143-ай таһалбариин сэн хэрэглэжэ, RC-LH114-W ба RC-LH116-ай һүүлшын загбарай шиидхэбэри тус тусдаа 2.65 ба 2.80Å болоно. Һүүлшын загбарай FSC мурые 2-дохи зураг дээрэ харуулаа. S17.
Бүхы уурагуудые UniProtKB-һээ татажа абаһан байна: LH1-β (PufB; UniProt ID: Q6N9L5); LH1-α (PufA; UniProtID: Q6N9L4); RC-L (PufL; UniProt ID: O83005); RC-M (PufM; UniProt ID: A0A4Z7); RC-H (PuhA; UniProt ID: A0A4Z9); Уураг-W (PufW; UniProt ID: Q6N1K3). SWISS-MODEL (45) RC-L, RC-M ба RC-H уурагуудай дараалалнуудые ба Rba-гай кристалл бүтэсэтэй RC-эй гомологиин загбарые бүтээхэдээ хэрэглэгдээ. sphaeroides RC загбар болгон хэрэглэгдээ (PDB ID: 5LSE) (46). UCSF Chimera-да “fit map” хэрэгсэл хэрэглэн, үүсхэгдэһэн загбарые картада тааруулха (47), уураг бүтэсые һайжаруулха, кофактор [4×BChl a (мономерэй номой сангай үлэгдэл нэрэ = BCL), 2×BPh a (BPH), нэгэ гү, али хоёр янзын UQ10 (U10), нэгэ гем бэшэ түмэр (Fe) ба нэгэ гексагидролингидробон (QAK)] нэмэхэдээ Coot (48) хэрэглэхэ. QAK мономерэй номой сан соо үгы тула PHENIX (49) соохи eLBOW хэрэгсэл хэрэглэн параметризацилагдаһан байна.
Удаань, LH1 дэд нэгэдэл бүтээгдэһэн байна. Анхандаа PHENIX (49) соохи автомат бүтээлгын хэрэгсэл карта болон LH1-α ба LH1-β уурагуудай дараалалнуудые оролто болгон хэрэглэн LH1 дараалалнуудай хэһэгые автоматаар бүтээхэ хэрэгсэл болоһон байна. LH1-эй эгээл дүүрэн дэд нэгэдэлые шэлэжэ, тэрэнээ гаргажа, Coot-да оруулха, тэрээн соо үгы байһан дараалалые гараар нэмэжэ, хоёр BCls a (BCL) ба спириллоксантин (CRT) нэмэхэһээ урид бүхы бүтэсые гараар нарижуулха [холбоото Rps-эй ёһоор LH1 комплексын нягта ба мэдээжэ каротиноид агууламжа. Зүйлнүүд (17)]. LH1 дэд нэгэдэлые бүрин хуулажа, UCSF Chimera “Docking Map Tool” хэрэглэн LH1 нягтатай зэргэлээд байһан загбар бэшэ газарта док хэжэ, удаань Coot-да нарижуулха; бүхы LH1 дэд нэгэдэлнүүдые загбарлаха болотор энэ үйлэ ябасые дабтаха. RC-LH114-W бүтэсэ, Coot-да хубаагдаагүй нягтые гаргажа, уурагые USCF Chimera карта дээрэхи үлэһэн уураг бэшэ бүридүүлэгшэһээ хубаажа, анханай загбарые байгуулхада Autobuild хэрэгсэл хэрэглэжэ, үлэһэн дэд нэгэдэлнүүдые (уураг-W) загбарлажа байна. ФЕНИКС (49) соо. Coot (48)-дахи үрэ дүнтэй загбарта дутуу дараалалнуудые нэмэжэ, бүхы дэд нэгэдэлые гараар нарижуулха. Үлэһэн хубаагдаагүй нягташал липидүүдэй хослолдо таарана (PDB мономер библиотекын ID CDL = CDL, POPC = 6PL ба POPG = PGT), β-DDM угаалгын бодос (LMT) ба UQ10 молекуланууд (U10). PHENIX оновчтой болгохо (49) ба Coot (48)-да гараар оновчтой болгохо хэрэглэн, загбарай статистика болон тааралдалай үзэгдэлэй шанарые саашань һайжаруулха аргагүй болотор бүрин анханай загбарые һайжаруулха. Һүүлдэнь, LocScale (50) хэрэглэн, нютагай карта хурсадхаад, удаань хубаагдаагүй нягтые загбарлаха, автомат ба гараар оностой болгохо хэдэн бусад циклнүүдые хэхэ.
Тус тусдаа пептидүүд, кофакторнууд болон бусад липидүүд болон хинонууд тус тусдаа нягта дотороо 1 ба 2-дохи зурагуудта харуулагдана. S18-һаа S23 хүрэтэр. Һүүлшын загбарай статистикын мэдээсэл S1 таблицада харуулагдана.
Хэрбээ ондоогоор заагдаагүй һаа, UV/Vis/NIR шэнгээхэ спектрнүүдые Cary60 спектрофотометр дээрэ (Agilent, USA) 250 нм-һээ 1000 нм хүрэтэр 1 нм зайтайгаар ба 0.1с интеграциин хугасаагаар суглуулаа.
Дээжые 1-эй A880 хүрэтэр 2 мм замтай кварцын кюветэдэ шэлжүүлжэ, 400-һаа 1000 нм хүрэтэр шэнгээхэ спектр суглуулха. Түхэреэн дихрой спектрнүүдые Jasco 810 спектрополяриметр дээрэ (Jasco, Япон) 400 нм ба 950 нм хоорондохи 1 нм зайтайгаар 20 нм мин-1 сканерэй хурдаар суглуулаа.
Молярна үгы болохо коэффициентые гол комплексые ойролсоогоор 50 A880 хүрэтэр шэлжүүлжэ тодорхойлно. 10μl эзэлхүүниие 990μl холбохо буфер гү, али метанолдо шэлжүүлжэ, BChl-эй задаралые бага болгохын тулада шэнгээхэ спектрые дары суглуулха. Метанолой дээжэ бүхэнэй BChl агууламжа 771 нм-эй 54.8 мМ-1 см-1-эй үгы болохо коэффициентээр тоосогдожо, үгы болохо коэффициент тодорхойлогдоо (51). Хэмжэгдэһэн BChl концентрациие 32 (RC-LH114-W) гү, али 36 (RC-LH116)-да хубаажа, гол комплексын концентраци тодорхойлхо, энэнь удаань буферэй үгы болохо коэффициент соо суглуулагдаһан адли дээжэ шэнгээхэ спектр тодорхойлходо хэрэглэгдэдэг. параллел. Дээжын бүхэндэ гурба дахин хэмжүүр абажа, BChl Qy дээдын хэмжээнэй дунда зэргын шэнгээхэ шадабариие тоосоолходо хэрэглэбэ. 878 нм-тэ хэмжэгдэһэн RC-LH114-W-эй үгы болохо коэффициент 3280±140 мМ-1 см-1, харин 880 нм-тэ хэмжэгдэһэн RC-LH116-ай үгы болохо коэффициент 3800±30 мМ-1 см-1 болоно.
UQ10 (52)-дахи аргаар тодорхойлогдоһон байна. Тобшохоноор хэлэбэл, Agilent 1200 HPLC системэ хэрэглэн, урбуу үеын ВЭЖХ (RP-HPLC) хэгдэһэн байна. RC-LH116 гү, али RC-LH114-W-ые 50μl 50:50 метанол:хлороформ соо 0.02% (масс/объем) түмэрэй хлорид агуулһан соо 0.02 нмоль тухай RC-LH116 гү, али RC-LH114-W уһалжа, уридшалан тэнсүүлһэн Beckman Coulter Ultrasphere ODS 4mml-ые 1-1-мин-да уһалха. ×25 см багана дээрэ 40°C ВЭЖХ уһалдаг бодос (80:20 метанол:2-пропанол) соо. 275 нм (UQ10), 450 нм (каротиноидууд) ба 780 нм (BChl) шэнгээхэ шадабариие 1 часай туршада хинаха зорилгоор ВЭЖХ уһалдаг бодос соо изократическа элюци хэхэ. 25.5 минутын 275 нм хроматограммын орьёлые нэгэдхэһэн, энэнь бусад илгарха нэгэдэлнүүдые агуулдаггүй байгаа. Нэгэдэмэл талмайе 0-һоо 5.8 нмоль хүрэтэр сэбэр стандартнуудые тарилгаһаа тоосогдоһон калибровкын мурые үндэһэлжэ гаргажа абаһан UQ10-ай моляр хэмжээе тоосоходо хэрэглэнэ (Зураг S14). Дээжын бүхэниие гурба дахин шэнжэлһэн, мэдээсэгдэһэн алдуу дунда зэргын SD-тэй таарана.
RC-LH1 комплекс агуулһан 0.1 дээдын Qy шэнгээхэ урасхалые 30 мкМ мориной зүрхэнэй цитохром c2 (Merck, UK) ба 0-һоо 50 μMUQ2 (Merck, UK)-ээр бэлдэһэн байна. UQ2 концентраци бүхэндэ гурбан 1-мл дээжые бэлдэжэ, хэмжэхэһээ урид харанхыда бүрэн дадаха зорилгоор 4°C-та харанхыда һүниин туршада инкубаци хэбэ. Уусмалые 300 нм гал/500 шугамай тортой, 1.24 мм орохо, 0.12 мм дунда ба 0.6 мм гараха нүхэтэй OLIS RSM1000 модульна спектрофотометртэ оруулһан байна. Дээжын фотогуурһанай үүдэндэ 600 нм ута дамжуулагша шүүгшэ табигдажа, һэдэбшэлгын гэрэл үгы болгогдоно. Шингэлтэ 550 нм-тэ 0.15 с интеграциин хугасаатайгаар хинагдаһан байна. Һэдэлгын гэрэл 880 нм M880F2 LED (Light Emitting Diode) (Thorlabs Ltd., UK)-һээ DC2200 ударидагшаар (Thorlabs Ltd., UK) 90% эршэмтэй оптикын кабель дамжуулан гэрэлэй эхиндэ 90° булангаар дамжуулагдадаг. Хэмжэхэ туяа дээжэдэ анха шэнгээгдээгүй гэрэлые бусааха зорилгоор толидо эсэргүү байдаг. с-эй гэрэлтэхын урда 10 с-эй урда шэнгээхэ шадабариие хинаха. Удаань шэнгээхэ шадабариие 60 секундын туршада харанхыда саашань хинажа, хинолол цитохром c23 + -ые өөрынгөө дураар хэр зэргэ бууруулдагые сэгнэбэ (түүхэй мэдээсэлые S8 зураг харагты).
Мэдээллые 0.5-һаа 10 с хүрэтэр (UQ2 концентрациһаа хамааран) шугаман анханай хурдые тааруулжа, UQ2 концентраци бүхэндэ гурбан дээжын хурдые дунда зэргээр абажа болбосоруулһан байна. Тусхай үгы болохо коэффициентээр тоосогдоһон RC-LH1 концентрациие хурдые каталитик үрэ дүндэ хубилгахадаа хэрэглэбэ, Origin Pro 2019 (OriginLab, USA)-да зуража, Michaelis-Menten загбарта тааруулжа, илгарма Km ба Kcat сэнгүүдые тодорхойлбо.
Түргэн шэнгээхэ хэмжүүрэй түлөө RC-LH1 дээжые 50 мМ натрийн аскорбат (Merck, USA) ба 0.4 мМ Тербутин (Merck, USA) агуулһан IMAC буфер соо ~2μM хүрэтэр шэлжүүлһэн байна. Аскорбинай хүшэлые үргэл электрон донор болгон хэрэглэдэг, харин хэмжэхэ үйлэ ябасада гол RC донор багадхаһан (ондоогоор хэлэбэл, фотоисэлдэлтэгүй) байхые хангахын тулада трет-бутаклофен QB дарангылагша болгон хэрэглэгдэдэг. Ойролсоогоор 3 мл дээжые 2 мм оптикын замтай тусхай эргэдэг эстэ (диаметр 0.1 м оршом, 350 RPM) нэмэжэ, лазерай замда байһан дээжэ һэдэлгын импульсуудай хоорондо харанхыда дабшаха хангалтатай сагтай байхые хангадаг. ~100-fs лазерай импульс хэрэглэн Ti: Sapphire лазерай системые (Spectra Physics, USA) 1 кГц-эй дабталгын хурдаар 880 нм-ээр дээжые хүдэлгэхэ (NIR-дэ 20 нДж гү, али Vis-дэ 100 нДж). Мэдээсэл суглуулхынгаа урда тээ дээжые 30 минута тухай һэдэлгэтэй гэрэлдэ байлгаха хэрэгтэй. Нүлөөлэлгэ QA-гай эдэбхигүй болохо (магадгүй QA-ые нэгэ гү, али хоёр дахин багадхаха). Гэбэшье энэ үйлэ ябаса һөөргэнь бусаха аргатай гэжэ анхарха хэрэгтэй, юундэб гэхэдэ удаан хугасаанай туршада харанхыда дасан зохицоһоной һүүлдэ RC аажамаар QA үйлэ ажаллалгада бусаха. -10-һаа 7000 ps хүрэтэр хойшолуулалтатай дамжуулгын спектрнүүдые хэмжэхэдээ Helios спектрометр (Ultrafast Systems, USA) хэрэглэбэ. Surface Xplorer программна хангамжа (Ultrafast Systems, USA) хэрэглэн мэдээсэлэй багтаамжануудые бүлэглэжэ, удаань ниилүүлжэ стандартизацилха. CarpetView программын багтаамжа (Light Conversion Ltd., Lithuania) хэрэглэн, задаралтай холбоотой дифференциальна спектрнүүдые абахын тулада ниилмэл мэдээсэлэй багцые хэрэглэхэ гү, али Origin (OriginLab, USA)-да нэгэ долгиной спектральна хубилалтада тааруулхын тулада хэрэгсэлэй харюутай олон экспонентые холбодог функци хэрэглэхэ.
Дээрэ хэлэгдэһэнэй ёһоор (53), RC ба захын LH2 антеннагүй LH1 комплекс агуулһан фотосинтезэй пленкэ бэлдэгдэһэн байна. Мембраные 20 мМ трис (рН 8.0) соо шэлжүүлжэ, 2 мм оптикын замтай кварцын кюветэдэ оруулһан байна. Дээжые 540 нм-тэ -10-һаа 7000 пс хүрэтэр хойшолуулалтатайгаар һэдэбшүүлхын тулада 30нДж лазерай импульс хэрэглэбэ. Rps-дэ тодорхойлһон ёһоор мэдээсэлэй багцые болбосоруулха. нүхэрэй дээжэ.
Мембраные 150,000 RCF-дэ 4°C-та 2 часай туршада центрифугировалжа гранулировалһан, удаань 880 нм-эй шэнгээхэ шадабариие 20 мМ трис-HCl (рН 8.0) ба 200 мМ NaCl-дэ дахин суспендироваһан. 2% (w/v) β-DDM-ые 4°C-та харанхыда 1 часай туршада аалиханаар хүдэлгэжэ мембрана усадхаха. Дээжые 100 мМ триэтиламмоний карбонат (рН 8.0) (TEAB; Merck, UK)-да 2.5 мг мл-1 уураг концентрацида (Bio-Rad шэнжэлэл) шэлжүүлһэн байна. Саашадаа болбосоруулалта урид хэблэгдэһэн аргаар (54) 50 мкг уурагые 1% (w/v) натрийн лаурат (Merck, UK) агуулһан ниитэ 50 μl TEAB-да шэлжүүлһэнһээ эхилээд үнгэргэгдэбэ. секундын туршада ультразвугой аргаар хүдэлгэһэнэй удаа 37°C-та 30 минутын туршада 5 мМ трис(2-карбоксиэтил)фосфин (Merck, UK)-ээр багадхаһан байна. S-алкилировалгын тулада дээжые 10 мМ метил S-метилтиометансульфонат (Merck, UK)-тай инкубаци хэжэ, 200 мМ изопропанолой үндэһэн урасхалһаа 10 минутын туршада танхимай температурада нэмэхэ. Протеолит шэнжэлэлгэ 2 мкг трипсин/эндопротеиназа Lys-C холисо (Promega UK) нэмэжэ 37°C-та 3 часай туршада инкубаци хэгдэһэн байна. Лаурат гадаргуугай эдэбхитэй бодос 50 μl этилацетат ба 10 μl 10% (v/v) LC сортын трифторуксусай хүшэлтүрэгшэ (TFA; Thermo Fisher Scientific, UK) нэмэжэ, 60 с-эй туршада һэлгүүлжэ абтаһан байна. Фаза илгаралые 15,700 RCF-дэ 5 минутын туршада центрифугировалжа дэмжэһэн байна. Үйлэдбэрилэгшын протоколоор, C18 спин колонко (Thermo Fisher Scientific, UK) хэрэглэн, пептид агуулһан доодо үеые болгоомжотойгоор соргожо, дабһагүй болгобо. Вакуум центрифугировалгын аргаар хатааһанай удаа дээжые 0.5% TFA ба 3% ацетонитрилдэ уһалжа, 500 нг-ые урид дэлгэрэнгыгээр тодорхойлһон системын параметрнүүдые хэрэглэн масс-спектрометриин хослуулан нанофлот RP хроматографиин аргаар шэнжэлһэн байна.
Rps бэдэрхын тулада уураг таниха ба тоосохо MaxQuant v.1.5.3.30 (56) хэрэглэхэ. palustris протеомын мэдээсэлэй сан (www.uniprot.org/proteomes/UP000001426). Масс-спектрометриин протеомикын мэдээсэл PRIDE түншэдэй сан (http://proteomecentral.proteomexchange.org) дамжуулан PXD020402 мэдээсэлэй багтаамжын идентификатор доро ProteomeXchange Alliance-да хадагалагдаһан байна.
RPLC-ээр шэнжэлэлгын тулада электроспрей ионизациин масс-спектрометритэй хамта RC-LH1 комплексые зэрлиг түхэлэй Rps-һээ бэлдэһэн байна. Урдань хэблэгдэһэн арга хэрэглэн (16), palustris эсүүдтэ 20 мМ Hepes (pH 7.8), 100 мМ NaCl ба 0.03% (w/v) β- (Bio-Rad шэнжэлэл) ) DDM-дэ 2 мг мл-1 уураг үйлэдбэрилһэн байна. Үйлэдбэрилэгшын протоколой ёһоор, 2D сэбэрлэлгын хэрэгсэл (GE Healthcare, USA) хэрэглэн, 10 мкг уурагые тунамал аргаар гаргажа, тунадасые 20 мкл 60% (v / v) мэрээшэнэй хүшэлтүрэгшэ (FA), 20% (v / v) ацетонитрил ба 20% (v/v) уһанда усадхаха. Табан микролитрые RPLC (Dionex RSLC) масс-спектрометритэй (Maxis UHR-TOF, Bruker) хослуулан шэнжэлһэн байна. MabPac 1.2×100 мм багана (Thermo Fisher Scientific, UK) 60°C ба 100μlmin -1 температурада 85% (v / v) уһалагша А [0.1% (v / v) FA ба 0.02% (V/v) TFA уһанай урасхал] 85% Bv/v) уһалдаг градиенттайгаар тусгаарлахын тулада хэрэглэхэ [0.1%(v/v) FA ба 0.02%(v/v) 90%(v/v) ацетонитрил TFA-да] 60 минутаһаа дээшэ стандарт электроспрей ионизациин эхи ба стандарт параметрнүүдые хэрэглэжэ, масс-спектрометр 100-һаа 2750 м/з (масса-зарядай харисаа) абана. ExPASy биоинформатикын нөөсэ портал FindPept хэрэгсэлэй (https://web.expasy.org/findpept/) туһаламжаар массын спектрые комплексын дэд нэгэдэлнүүдтэ карта дээрэ харуулха.
Эсүүдые 100 мл NF-бага (10μMm-2 s-1), дунда (30μMm-2 s-1) гү, али ехэ (300μMm-2 s-1) гэрэл доро 72 часай туршада ургуулаа. М22 оршон (М22 оршон, эндэ аммониин сульфат орхигдоһон, натриин сукцинат натриин ацетат һэлгэгдэһэн) 100 мл-эй шургуулгатай шэл соо (23). Табан 30-сек цикл соо 0.1 микрон шэл шүрэнүүдые 1:1 эзэлхүүнэй харисаагаар шүрбэһэлжэ, эсүүдые лизировалжа, 5 минутын туршада мүльһэн дээрэ хүйтэн болгоо. Уһалдаггүй бодос, таһаршагүй эсүүд болон шэл шүрэнүүдые 16,000 RCF-дэ 10 минутын туршада шэрээ дээрэхи микроцентрифугада центрифугировалжа зайлуулһан байна. Мембраные 100,000 RCF-тэй 100,000 RCF-тэй 20 мМ tris-HCl (pH 8.0)-да 40/15% (w/w) сахарозын градиенттэй 10 часай туршада тусгаарлаһан байна.
Манай урданай ажалда тодорхойлһон ёһоор, PufW дээрэхи His тэмдэгэй иммунодетекци (16). Тобшохоноор хэлэбэл, сэбэрлэгдэһэн гол комплекс (11.8 нМ) гү, али 2x SDS ашаглалтын буфертэ (Merck, UK) хоёр дахин шэлжүүлһэн RC-эй адли концентрацитай мембрана (исэлдэлтэгээр багадхаһан илгаанай спектрые хаһажа, будагдаһан гель дээрэхи ашаглалгатай тааруулжа тодорхойлно) хоёр дахин шэлжүүлһэн байна. Уурагуудые 12% бис-трис NuPage гель (Thermo Fisher Scientific, UK) дээрэ тусгаарлаһан байна. RC-L дэд нэгэдэлые ашаглажа, харуулхын тулада гель Coomassie Brilliant Blue (Bio-Rad, UK) үнгөөр ​​будагдаа. Хоёрдохи гель дээрэхи уурагые иммуноанализ хэхэ зорилгоор метанолоор эдэбхижүүлһэн поливинилиден фторид (PVDF) мембранада (Thermo Fisher Scientific, UK) дамжуулһан байна. PVDF мембрана 50 мМ tris-HCl (pH 7.6), 150 мМ NaCl, 0.2% (v / v) Tween-20 ба 5% (w / v) һүнэй нунтаг соо хаагдаад, удаань анти-His анханай эсэргүү бодостой (dilute the buffer [5-HCl mM-HCl) соо инкубаци хэгдээ 7.6), 150 мМ NaCl ба 0.05% (v/v) Tween-20] 1:1000 A190-114A, Bethyl Laboratories, USA) 4 часай туршада. Эсэргүүсэлэй буфер соо 5 минутын туршада 3 дахин угааһанай удаа, мембраные хренэй пероксидаза (Sigma-Aldrich, UK) хулгана эсэргүү хоёрдохи эсэргүү бодостой (1:10,000 эсрэгбиеын буфертэ шэлжүүлһэн) холиһон байна. химилюминесценциин субстрат (Cyanagen, Italy) ба Amersham Imager 600 (GE Healthcare, UK).
Будагдаһан гель гү, али иммуноанализ бүхэнэй эршэм хүсэнэй хубаариие зуража, орьёл дорохи талмайе нэгэдхэжэ, RC-L (будагдаһан гель) ба Protein-W (иммуноанализ)-ай эршэм хүсэнэй харисаа тоосоолжо, ImageJ (57) Зурагые болбосоруулха. Эдэ харисаануудые сэбэр RC-LH114-W дээжэдэ RC-L ба уураг-W-эй харисаа 1:1 гэжэ тоолоод, бүхы мэдээсэлэй багцые тэрэнэй ёһоор нормализацилжа, моляр харисаануудта хубилгаа.
Энэ үгүүлэлэй нэмэлтэ материалнуудые http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/3/eabe2631/DC1 харагты
Энэ хадаа Creative Commons Attribution License-эй ёһоор тараагдаһан нээлтэтэ үгүүлэл юм. Анханай зохёолые зүбөөр дурдаһан ушарта үгүүлэл ямаршье аргаар хизаарлалтагүй хэрэглэхэ, тарааха, хубилгаха боломжо олгоно.
Анхарал: Хуудаһанда дурадхаһан хүнтнай энэ сахим бэшэгые харуулхыень хүсэжэ байһанаа, энэнь спам бэшэ гэжэ мэдэхын тулада бидэ гансал өөрынгөө сахим хаягые үгэхыетнай гуйнабди. Бидэ ямаршье сахим хаягуудые абахагүйбди.
Энэ асуудал таанадые айлшан гү гэжэ шалгаха ба автоматаар спам эльгээхэһээ сэргийлхэ хэрэгсэл болоно.
Дэвид Дж.К. Суэйнсбери, Парк Цянь, Филипп Дж. Джексон, Кейтлин М. Фарис, Дариуш М. Недзвиецки, Элизабет К. Мартин, Дэвид А. Фармер, Лорна А. Малоун, Ребекка Ф. Томпсон, Нил А. Рэнсон, Даниэль П. Каннифф, Марк Дж. Дикман, Дьюи Холтен, Кристина Кирма, Эндрю Хитчер Хантер.
Реакциин түбтэ гэрэлэй урбалай 1 комплексын үндэр нарибшалалтай бүтэсэ хиноной динамикын талаар шэнэ ойлгосо үгэнэ.
Дэвид Дж.К. Суэйнсбери, Парк Цянь, Филипп Дж. Джексон, Кейтлин М. Фарис, Дариуш М. Недзвиецки, Элизабет К. Мартин, Дэвид А. Фармер, Лорна А. Малоун, Ребекка Ф. Томпсон, Нил А. Рэнсон, Даниэль П. Каннифф, Марк Дж. Дикман, Дьюи Холтен, Кристина Кирма, Эндрю Хитчер Хантер.
Реакциин түбтэ гэрэлэй урбалай 1 комплексын үндэр нарибшалалтай бүтэсэ хиноной динамикын талаар шэнэ ойлгосо үгэнэ.
©2021 Эрдэм ухаанай хүгжэлэй Америкын холбоо. бүхы эрхэнүүд хамгаалагдаһан. AAAS хадаа HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef болон COUNTER-эй түншэ юм. Эрдэм ухаанай дэбжэлтэ ISSN 2375-2548.